ኢሚዩኖሞዱላቶሪ ሜታቦላይትስ ቁልፊ ባህሪ ናይቲ ቲሞር ማይክሮኢንቫይሮመንት (TME) ኮይኑ፡ ብዘይካ ውሑዳት ግን መንነቶም ብዓቢኡ ኣይተፈልጠን። ኣብዚ፡ ካብ ሕበጥን ዋህዮታት ቲን ካብ ሕበጥን ኣሲትስን ልዑል ደረጃ ሴሮስ ካርሲኖማ (HGSC) ዘለዎም ሕሙማት ብምትንታን፡ ሜታቦሎም ናይዞም ዝተፈላለዩ ክፍልታት TME ኣቃሊዕና። ኣሲትስን ዋህዮታት ሕበጥን ሰፊሕ ናይ መተቦላይት ፍልልይ ኣለዎም። ምስ ኣሲትስ ክነጻጸሩ እንከለዉ፡ እቶም ኣብ ሕበጥ ዝኣትዉ ዋህዮታት ቲ ብ1-ሜቲልኒኮቲናማይድ (MNA) ብዓቢኡ ይሃብተሙ። ኣብ ዋህዮታት ቲ ደረጃ MNA ልዑል እኳ እንተኾነ፡ መግለጺ ኒኮቲናማይድ ኤን-ሜቲልትራንስፈረዝ (ካብ ኤስ-ኣዴኖሲልሜቲዮኒን ናብ ኒኮቲናማይድ ንዝሰጋገሩ ጉጅለታት ሜቲል ዝድርኽ ኢንዛይም) ኣብ ፋይብሮብላስትን ዋህዮታት ሕበጥን ጥራይ ዝተሓጽረ እዩ። ብተግባር፡ MNA ንዋህዮታት T ነቲ ንሕበጥ ዘተባብዕ ሳይቶኪን ሕበጥ ኔክሮሲስ ፋክተር ኣልፋ ንኽፍንዉ ይድርኾም። ስለዚ፡ ካብ TME ዝተረኽበ MNA ኣብ ምቁጽጻር ሕማም ምክልኻል ዋህዮታት T ኣበርክቶ ዝገብርን ንሕክምና መንሽሮ ደቂ ሰባት ክኸውን ዝኽእል ዕላማ ኢሚዩኖቴራፒ ዝውክልን እዩ።
ካብ ሕበጥ ዝመጹ መተቦላይትስ ኣብ ጸረ-ሕበጥ ሕማም ምክልኻል ዓሚቝ ተዓጻጻፊ ጽልዋ ክህልዎም ይኽእል እዩ፣ ዝያዳ መርትዖታት ከም ዘመልክትዎ ድማ ንዕቤት ሕማም ከም ቀንዲ ድርኺት ሓይሊ ኮይኖም ከገልግሉ ከም ዝኽእሉ’ውን ይሕብሩ (1)። ብዘይካ’ቲ ዋርበርግ ውጽኢት፡ ኣብ ቀረባ እዋን ዝተገብረ ስራሕ፡ ንኹነታት ምምሕያሽ መግቢ ዋህዮታት ሕበጥን ምስ ኩነታት ምክልኻል ሕማም ናይቲ ሕበጥ ማይክሮኢንቫይሮመንት (TME) ዘለዎ ርክብን ንምልላይ ተጀሚሩ ኣሎ። ኣብ ሞዴላት ኣንጭዋን ቲ ሴላት ሰብን ዝተገብረ መጽናዕቲ ከም ዘመልክቶ፡ ምትሕልላፍ ግሉታሚን (2)፡ ምትሕልላፍ ኦክሲዳቲቭ (3)ን ምትሕልላፍ ግሉኮስ (4)ን ኣብ ዝተፈላለዩ ንኡሳን ጉጅለታት ዋህዮታት ምክልኻል ሕማም ብናጻ ክሰርሑ ይኽእሉ። ኣብዞም መንገድታት ዝርከቡ ሓያሎ መተቦላይትስ ንጸረ-ሕበጥ ስራሕ ዋህዮታት ቲ ይዓግቱ። ምዕጋት ናይቲ ኮኢንዛይም ቴትራሃይድሮባዮፕተሪን (BH4) ንብዝሒ ዋህዮታት ቲ ክጎድእ ከም ዝኽእልን፡ ኣብ ኣካላትና ምውሳኽ BH4 ድማ ነቲ ብሲዲ4ን ሲዲ8ን ዝመሓላለፍ ጸረ-ሕበጥ ናይ ምክልኻል ምላሽ ከዕብዮ ከም ዝኽእል ተረጋጊጹ ኣሎ። ብተወሳኺ፡ እቲ ናይ ኪኑረኒን ኢሚዩኖሱፕረሲቭ ውጽኢት ብኣመሓዳሪ BH4 ክድሕን ይኽእል (5)። ኣብ isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma፡ ምፍሳስ enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) T cell activation, proliferation and cytolysis Activity (6) ይዓግት። ኣብ ቀረባ እዋን፡ ሜቲልግላይዮክሳል፡ ጐድናዊ ፍርያት ግላይኮላይሲስ፡ ብማይሎይድ መበቆል ዘለዎም ሳፕረሰር ዋህዮታት ከም ዝፍጠርን፡ ምትሕልላፍ ቲ ሴል ሜቲልግሊዮክሳል ድማ ንስራሕ ኤፌክተር ቲ ዋህዮታት ክዓግቶ ከም ዝኽእልን ተረጋጊጹ ኣሎ። ኣብ ሕክምና፡ ኒውትራላይዜሽን ሜቲልግላይዮክሳል ንንጥፈታት ማይሎይድ-ዝተረኽቡ ሱፕረሰር ዋህዮታት (MDSC) ክስዕርን ኣብ ሞዴላት ኣንጭዋ ንዝግበር ፍወሳ ምፍታሽ ነጥቢ ምዕጋት ብሓባራዊ መንገዲ ከዕብዮን ይኽእል (7)። እዞም መጽናዕትታት ብሓባር፡ ካብ TME ዝመጹ መተቦላይትስ ኣብ ምቁጽጻር ስራሕን ንጥፈታትን ዋህዮታት ቲ ዘለዎም ቁልፊ ተራ ዘጉልሑ እዮም።
ምዝንባዕ ዋህዮታት ቲ ኣብ መንሽሮ ማህጸን ብሰፊሑ ተገሊጹ ኣሎ (8)። እዚ ብኸፊል ብሰንኪ እቲ ኣብ ምጉዳል ኦክስጅንን ዘይንቡር ሰራውር ደም ሕበጥን (9) ተፈጢሩ ዘሎ ናይ ምምሕያሽ ባህርያት ኮይኑ፡ ውጽኢቱ ድማ ግሉኮስን ትሪፕቶፋንን ናብ ከም ላክቲክ ኣሲድን ኪኑረኒንን ዝኣመሰሉ ጐድናዊ ፍርያት ይቕየሩ። ካብ መጠን ንላዕሊ ውጽእ ዋህዮ ላክቴት ንፍርያት ኢንተርፈሮን-γ (IFN-γ) ይንክዮን ንፍልልይ ማይሎሱፕረሲቭ ንኡሳን ጉጅለታት ይድርኽን (10, 11)። ምውሳድ ትሪፕቶፋን ብቐጥታ ንብዝሒ ዋህዮታት ቲ ይዓግቶን ምልክት ተቐባሊ ዋህዮታት ቲ ይዓግቶን (12-14)። እዚ ትዕዝብትታት እዚ እናሃለወ፡ ብዙሕ ስራሕ ኣብ ዙርያ ናይ ሕማም ምክልኻል ምትሕልላፍ ኣብ ውሽጢ መርመራ ቲ ዋህዮ ባህሊ ዝተመቻቸወ መራኸቢ ብዙሃን ተጠቒምካ ተኻይዱ፡ ወይ ድማ ኣብ ሆሞሎጂካዊ ሞዴላት ኣንጭዋ ኣብ vivo ዝተሓጽረ ኮይኑ፡ ክልቲኦም ምሉእ ብምሉእ ዘይምስምማዕ መንሽሮታት ደቂ ሰባትን ፊዚዮሎጂካዊ ማክሮን ማይክሮን ከባቢን ዘንጸባርቑ ኣይኮኑን።
ልሙድ መለለዪ መንሽሮ ማህጸን ዝርገሐ ፐሪቶንያን ምምጻእ ኣሲትስን እዩ። ኣብ ኣሲትስ ምውህላል ፈሳሲ ዋህዮታት ምስ ምዕቡል ሕማምን ድኹም ትንበያን ዝተኣሳሰር እዩ (15)። ብመሰረት ጸብጻባት እዚ ፍሉይ ክፍሊ ትሑት ኦክስጅን ዘለዎ ኮይኑ፡ ልዑል መጠን ቫስኩላር ኢንዶተልያል ግሮውዝ ፋክተር (VEGF)ን ኢንዶሊኣሚን 2,3-ዳይኦክሲጀነዝ (IDO)ን ዘለዎ ኮይኑ፡ ብቲ ረጉላቶሪ ሴልስን ማይሎይድ ኢንሂቢቶሪ ሴልስን (15-18) ዝሰሓበ እዩ። ናይ ኣሲትስ መቦሊክ ሃዋህው ካብቲ ናይቲ ሕበጥ ባዕሉ ዝተፈልየ ክኸውን ይኽእል እዩ፣ ስለዚ ዳግመ ፕሮግራም ናይ ቲ ዋህዮታት ኣብ ፐሪቶንያል ስፔስ ንጹር ኣይኮነን። ብተወሳኺ ኣብ ከባቢ ሕበጥ ዝርከቡ ኣብ መንጎ ኣሲትስን መተቦላይትስን ዘሎ ቁልፊ ፍልልያትን ዘይምስምማዕን ዋህዮታት ምክልኻል ሕማምን ኣብ ሕበጥ ዘለዎም ስራሕን ክዕንቅፍ ስለዝኽእል ተወሳኺ መጽናዕቲ የድሊ።
ነዞም ጸገማት ንምፍታሕ፡ ዝተፈላለዩ ዓይነታት ዋህዮታት (CD4 +ን CD8 + T ዋህዮታት ሓዊሱ) ከምኡ’ውን ኣብ ውሽጢን ኣብ መንጎን ሕበጥ ንምጽናዕ ተሃዋሲ ምፍላይ ዋህዮታትን ፈሳሲ ክሮማቶግራፊን ታንደም ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS/MS) ሜላ ዲዛይን ጌርና፡ ከምኡ’ውን ኣብ ውሽጢን ኣብ መንጎን ሕበጥ Its metabolites span cells in the same ascites and tumor environment of the patient. ነዚ ኣገባብ ምስ ልዑል-መዳይ ፍሎው ሳይቶሜትሪን ንጽል-ዋህዮ RNA መስርዕ (scRNA-seq) ተተሓሒዙ ንጥቀመሉ፡ ልዑል ፍታሕ ዘለዎ ስእሊ ናይዞም ቁልፊ ህዝብታት መቦሊክ ኩነታት ንምቕራብ። እዚ ኣገባብ እዚ ኣብ ዋህዮታት ቲ ሕበጥ ደረጃ 1-ሜቲልኒኮቲናማይድ (MNA) ርኡይ ወሰኽ ከምዘርኣየን፡ ኣብ ውሽጢ መርመራታት ዝተገብረ ፈተነታት ድማ፡ MNA ኣብ ስራሕ ዋህዮታት ቲ ዘለዎ ኢሚዩኖሞዱላቶሪ ጽልዋ ቅድሚ ሕጂ ከምዘይፍለጥ ኣረጋጊጹ። ብሓፈሻ እዚ ኣገባብ ኣብ መንጎ ሕበጥን ዋህዮታት ምክልኻል ሕማምን ዘሎ ሓድሕዳዊ ምትእስሳር ምትሕውዋስ መግቢ የቃልዕ፣ ከምኡ’ውን ኣብ ምትሕውዋስ ምቁጽጻር ሕማም ምክልኻል ፍሉይ ርድኢት ይህብ፣ እዚ ድማ ንሕክምና ዋህዮታት ቲ መሰረት ዝገበረ ናይ ሕማም ምክልኻል መንሽሮ ማህጸን ዕድላት ሕክምና ጠቓሚ ክኸውን ይኽእል።
ንሕና ልዑል-መዳይ ዋሕዚ ሳይቶሜትሪ ብሓንሳብ ብቑጽሪ ምውሳድ ግሉኮስ ተጠቒምና [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)ን mitochondrial ንጥፈት [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ጎኒ ንጎኒ ልሙድ እዮም። ንዋህዮታት ምክልኻል ሕማምን ንህዝቢ ዋህዮታት ሕበጥን ዝፈልዩ ምልክታት (ሰንጠረዥ S2ን ስእሊ S1Aን)። እዚ ትንተና ከም ዘመልክቶ፡ ምስ ዋህዮታት ቲ ክነጻጸር እንከሎ፡ ዋህዮታት ኣሲትስን ሕበጥን ዝለዓለ ደረጃ ምውሳድ ግሉኮስ ከም ዘለዎምን፡ ኣብ ንጥፈታት ማይቶኮንድርያ ግን ዝነኣሰ ፍልልይ ከም ዘለዎምን ኣረጋጊጹ። ማእከላይ ምውሳድ ግሉኮስ ናይ ዋህዮታት ሕበጥ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ካብ ሰለስተ ክሳብ ኣርባዕተ ዕጽፊ ናይ T ዋህዮታት ኮይኑ፡ ማእከላይ ምውሳድ ግሉኮስ ናይ CD4 + T ዋህዮታት ድማ 1.2 ዕጽፊ ናይ CD8 + T ዋህዮታት ኮይኑ፡ እዚ ድማ Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) ዋላ ኣብ ሓደ TME ዝተፈላለየ ናይ ምምሕያሽ ምግቢ ጠለባት ከም ዘለዎም የመልክት (ስእሊ 1A)። ብኣንጻሩ ኣብ ዋህዮታት ሕበጥ ዝረአ ንጥፈታት ማይቶኮንድርያ ምስ ናይ CD4 + T ዋህዮታት ዝመሳሰል ኮይኑ፡ ናይ ክልቲኦም ዓይነታት ዋህዮታት ማይቶኮንድርያል ንጥፈታት ድማ ካብ ናይ CD8 + T ዋህዮታት ዝለዓለ እዩ (ስእሊ 1B)። ብሓፈሻ እዞም ውጽኢታት ደረጃ ምትሕውዋስ መግቢ ዘቃልዑ እዮም። ናይ ዋህዮታት ሕበጥ ናይ ምትሕውዋስ ንጥፈታት ካብ ናይ CD4 + T ዋህዮታት ዝለዓለ ኮይኑ፡ ናይ CD4 + T ዋህዮታት ምትሕልላፍ መግቢ ድማ ካብ ናይ CD8 + T ዋህዮታት ዝለዓለ እዩ። እዚ ጽልዋታት ኣብ መላእ ዓይነታት ዋህዮታት እኳ እንተሃለወ፡ ኣብ ኩነታት ምምሕያሽ መግቢ CD4 +ን CD8 + T ዋህዮታት ወይ ኣብ ኣሲትስ ምስ ሕበጥ ክነጻጸር እንከሎ ኣብ ኣንጻራዊ መጠኖም ዝኾነ ቅኑዕ ፍልልይ የለን (ስእሊ 1C)። ብኣንጻሩ ኣብቲ CD45-cell fraction፡ ብዝሒ EpCAM+ cells ኣብቲ ሕበጥ ምስ ascites ክነጻጸር እንከሎ ወሰኸ (ስእሊ 1D)። ኣብ መንጎ EpCAM+ን EpCAM-ን ባእታታት ዋህዮታት ንጹር ናይ ምምሕያሽ መግቢ ፍልልይ እውን ተዓዚብና። EpCAM+ (tumor) ዋህዮታት ካብ EpCAM- ዋህዮታት ዝለዓለ ናይ ግሉኮስ ምውሳድን ማይቶኮንድርያል ንጥፈትን ኣለዎም፣ እዚ ድማ ካብቲ ኣብ TME ዝርከቡ ዋህዮታት ሕበጥ ዝርከቡ ፋይብሮብላስትስ ናይ ምምሕያሽ ንጥፈት ኣዝዩ ዝለዓለ እዩ (ስእሊ 1፣ Eን Fን)።
(A and B) ማእከላይ ጽዓት ፍሎረሰንስ (MFI) ናይ ግሉኮስ ምውሳድ (2-NBDG) (A)ን ማይቶኮንድርያል ንጥፈት ናይ CD4 + T ዋህዮታት (MitoTracker ጸሊም ቀይሕ) (B) ተወከልቲ ግራፍ (ጸጋም)ን ኣብ ሰሌዳ ዝተቐመጠ ዳታን (የማን)፡ CD8 + T ዋህዮታትን EpCAM + CD45-tumor ዋህዮታትን ካብ ኣሲትስን ሕበጥን። (C) ሬሾ ዋህዮታት CD4 +ን CD8 +ን (ናይ CD3 + T ዋህዮታት) ኣብ ኣሲትስን ሕበጥን። (D) ብዝሒ EpCAM + ዋህዮታት ሕበጥ ኣብ ኣሲትስን ሕበጥን (CD45−)። (E and F) EpCAM + CD45-tumor and EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) ከምኡ’ውን ማይቶኮንድርያል ንጥፈት (MitoTracker ጸሊም ቀይሕ) (F) ተወከልቲ ግራፍ (ጸጋም)ን ኣብ ሰሌዳ ዝተቐመጠ ዳታን ( የማን) ኣሲትስን ዋህዮታት ሕበጥን። (G) ውክልና ግራፍ ናይ CD25, CD137ን PD1ን መግለጺ ብፍሎው ሳይቶሜትሪ። (H and I) CD25, CD137ን PD1ን መግለጺ ኣብ CD4 + T ዋህዮታት (H) ከምኡ’ውን CD8 + T ዋህዮታት (I)። (J and K) ኣብ መግለጺ CCR7ን CD45ROን ዝተመርኮሰ ናይቭ፣ ማእከላይ ዝኽሪ (Tcm)፣ ኢፌክተር (Teff)ን ኢፌክተር ዝኽሪ (Tem)ን ፊኖታይፕ። ተወከልቲ ምስልታት (ጸጋም)ን ሰንጠረዥ መረዳእታን (የማን) ናይ CD4 + T ዋህዮታት (J)ን CD8 + T ዋህዮታት (K)ን ኣብ ኣሲትስን ሕበጥን። ብጽምዲ t-test (*P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001) ዝተወሰነ P ክብርታት። እቲ መስመር ንዝተመጣጠኑ ሕሙማት (n = 6) ይውክል። FMO, ፍሎረሰንስ ኣጉዲልካ ሓደ፤ MFI, ማእከላይ ጽዓት ፍሎረሰንስ.
ተወሳኺ ትንተና ኣብ መንጎ እቲ ኣዝዩ ዝተፈትሐ ቲ ሴል ፊኖታይፒክ ኩነታት ካልእ ርኡይ ፍልልያት ከምዘሎ ኣረጋጊጹ። ኣብ ሕበጥ ዝርከብ ኣክቲቬትድ (ስእሊ 1፣ ካብ G ክሳብ I)ን ኢፌክተርን ዝኽሪ (ስእሊ 1፣ Jን Kን) ካብ ኣሲትስ (ብዝሒ ዋህዮታት CD3 + T) ኣዝዩ ዝበዝሐ እዩ። ብተመሳሳሊ፡ ነቲ ፊኖታይፕ ብመግለጺ ናይ ምንቅስቓስ ምልክታት (CD25ን CD137ን)ን ምውዳቕ ምልክታትን [ፕሮግራም ዘለዎ ሞት ዋህዮ ፕሮቲን 1 (PD1)] ምትንታን፡ ዋላ’ኳ ናይዞም ህዝብታት ምትሕውዋስ ባህርያት ዝተፈላለየ እንተኾነ (ስእሊ S1, B ክሳብ E) , ግን ኣብ መንጎ ንኡሳን ንኡሳን ጕጅለታት ንኡሳን ጕጅለታት ንኡሳን ስብስባት ንጥፈት፡ ጽልዋ ወይ ምዝካር ብቐጻሊ ርኡይ ዝኾነ ናይ ምትሕውዋስ ፍልልይ ኣይተራእየን። እዞም ውጽኢታት ብኣውቶማቲክ ፊኖታይፕ ዋህዮታት ንምምዳብ ማሽን ትምህርቲ ሜላታት ብምጥቃም ተረጋጊጾም (21)፣ እዚ ድማ ብተወሳኺ ኣብ ምሕቃቕ ደም ናይቲ ሕሙም ብዙሕ ቁጽሪ ዘለዎም ዋህዮታት ምሕዋስ ዓጽሚ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ከምዘለዉ ኣረጋጊጹ (ስእሊ S2A)። ካብ ኩሎም ዝተለለዩ ዓይነታት ዋህዮታት፡ እዚ ማይሎይድ ዋህዮ ህዝቢ ዝለዓለ ምውሳድ ግሉኮስን ንጥፈት ማይቶኮንድርያን ኣርእዩ (ስእሊ S2፡ B ክሳብ G)። እዞም ውጽኢታት ኣብ መንጎ እቶም ኣብ ኣሲትስን ሕበጥን ኣብ ሕሙማት HGSC ዝርከቡ ብዙሓት ዓይነታት ዋህዮታት ዘሎ ሓያል ናይ ምትሕውዋስ ፍልልያት ዘጉልሑ እዮም።
ንሜታቦኖሚክ ባህርያት TIL ኣብ ምርዳእ እቲ ቀንዲ ብድሆ እኹል ጽሬት፣ ጽሬትን ብዝሕን ዘለዎም ናሙናታት ቲ ሴል ካብ ሕበጥ ምፍላይ ኣድላይነት እዩ። ኣብ ቀረባ እዋን ዝተገበሩ መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ፡ ኣብ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ዝተመርኮሰ ኣገባብ ምፍላይን ምህብታም ምልክትን ኣብ ዋህዮኣዊ መተቦላይት ፕሮፋይላት ለውጢ ከምጽእ ይኽእል እዩ (22-24)። ነዚ ጸገም ንምብዳህ፡ ቅድሚ ብLC-MS/MS ትንተና ምግባር፡ ካብ ብመጥባሕቲ ዝተቖርጸ መንሽሮ ማህጸን ሰብ TIL ንምንጻልን ንምንጻልን ነቲ ናይ ምልክት ምህብታም ኣገባብ ምምሕያሽ ኣመዝጊብናዮ (ንዋትን ኣገባባትን ርአ፤ ስእሊ 2A)። እዚ ፕሮቶኮል ኣብ ለውጢ መተቦላይት ዘለዎ ሓፈሻዊ ጽልዋ ንምግምጋም፡ ድሕሪ’ዚ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ ስጉምቲ ምፍላይ ምልክት ምልክት ብጥዑያት ለገስቲ ዝተንቀሳቐሱ ዋህዮታት ቲ፡ ፕሮፋይላት መተቦላይት ፕሮፋይላት ምስቶም ብቢድ ዘይተፈለዩ ግን ከኣ ኣብ በረድ ዝተረፉ ዋህዮታት ኣነጻጺርናዮ። እዚ ትንተና ቁፅፅር ፅሬት ኣብ መንጎ እዞም ክልተ ኩነታት ልዑል ምትእስሳር ከምዘሎ (r = 0.77)፣ ቴክኒካዊ ተደጋጋምነት ናይቲ 86 መተቦላይት ዝሓዘ ጉጅለ ድማ ልዑል ተደጋጋምነት ከምዘለዎን ረኺቡ (ስእሊ 2B)። ስለዚ እዞም ኣገባባት ኣብ ዓይነት ዋህዮ ምህብታም ኣብ ዝግበረሎም ዋህዮታት ቅኑዕ ትንተና መተቦላይት ክገብሩ ይኽእሉ፣ በዚ ድማ ኣብ HGSC ፍሉያት መተቦላይት ንምልላይ ናይ መጀመርታ ልዑል ርዝነት ዘለዎ መድረኽ ይህቡ፣ በዚ ድማ ሰባት ብዛዕባ ፍሉይነት ዋህዮታት ዝዓሞቐ ርድኢት ክረኽቡ የኽእሉ።
(ሀ) ስኬማዊ ስእላዊ ስእሊ ምህብታም ማግኔታዊ ምልክት። ቅድሚ ብLC-MS/MS ምትንታን እቶም ዋህዮታት ሰለስተ ተኸታተልቲ ዙርያታት ምህብታም ማግኔታዊ ምልክት ምልክት ክገብሩ ወይ ኣብ በረድ ክጸንሑ እዮም። (ለ) ጽልዋ ዓይነት ምህብታም ኣብ ብዝሒ መተቦላይት። ማእከላይ ደረጃ ሰለስተ መለክዒታት ንነፍሲ ​​ወከፍ ዓይነት ምህብታም ± SE. እቲ ግራጭ መስመር 1:1 ዝምድና ይውክል። ኣብ ውሽጢ ክፍሊ ምትእስሳር (ICC) ናይ ተደጋጋሚ መለክዒታት ኣብ ምልክት ኣክሲስ ዝተርኣየ። NAD, ኒኮቲናማይድ ኣዴኒን ዳይኑክሊዮታይድ። (ሐ) ስኬማዊ ስእላዊ ስእሊ ዋሕዚ ስራሕ ትንተና መተቦላይት ሕሙማት። ኣሲትስ ወይ ሕበጥ ካብ ሕሙማት ተኣኪቡ ብክራይዮ ይዕቀብ። ንእሽቶ ክፋል ናይ ነፍሲ ወከፍ ናሙና ብፍሎው ሳይቶሜትሪ ክትንተን እንከሎ፡ እቶም ዝተረፉ ናሙናታት ድማ ንCD4+, CD8+ን CD45- ዋህዮታት ሰለስተ ዙርያ ምህብታም ተገይሩሎም። እዞም ክፋላት ዋህዮታት ብLC-MS/MS ተጠቒሞም እዮም ተተንቲኖም። (መ) ካርታ ሙቐት ደረጃ ዝሓለወ ብዝሒ መተቦላይት። እቲ ደንድሮግራም ዋርድ ኣብ መንጎ ናሙናታት ዘሎ ናይ ዩክሊድ ርሕቀት ምትእኽኻብ ይውክል። (E) ትንታነ ዋና ባእታ (PCA) ናይ ናሙና ሜታቦላይት ካርታ፣ ሰለስተ ምድግጋም ናይ ነፍሲ ወከፍ ናሙና ዘርኢ፣ ካብ ሓደ ሕሙም ዝተወሰዱ ናሙናታት ብመስመር ዝተኣሳሰሩ እዮም። (F) ፒሲኤ ናይቲ ኣብ ልዕሊ እቲ ሕሙም ዝተቐመጠ ናሙና መተቦላይት ፕሮፋይል (ማለት ከፊላዊ ትርፊ ብምጥቃም)፤ እቲ ናሙና ዓይነት ብኮንቨክስ ሽፋን ድሩት እዩ። PC1, ቀንዲ ኣካል 1፤ PC2, ቀንዲ ኣካል 2.
ቀጺልና ነዚ ናይ ምህብታም ኣገባብ ተግባራዊ ብምግባር ኣብ መባእታዊ ኣሲትስን ሕበጥን ሽዱሽተ ሕሙማት HGSC (ስእሊ 2C፡ ስእሊ S3Aን ሰሌዳ S3ን S4ን) ኣብ ዝርከቡ ክፋላት ዋህዮታት CD4 +, CD8 +ን CD45ን 99 መተቦላይት ተንቲንናዮም። እቲ ተገዳስነት ዘለዎ ህዝቢ ካብቲ መበቆላዊ ዓቢ ናሙና ህያዋን ዋህዮታት ካብ 2% ክሳብ 70% ዝሕዝ ኮይኑ፡ ብዝሒ ዋህዮታት ኣብ መንጎ ሕሙማት ኣዝዩ ይፈላለ እዩ። ድሕሪ ምፍላይ እቶም ምልክት፡ እቲ ዝተሃብተመ ክፋል ተገዳስነት (CD4+, CD8+ ወይ CD45-) ብማእከላይ ገምጋም ልዕሊ 85% ካብ ኩሎም ኣብቲ ናሙና ዘለዉ ህያዋን ዋህዮታት ይሕዝ። እዚ ናይ ምህብታም ኣገባብ ካብ ምትሕልላፍ ቲሹ ሕበጥ ሰብ ንህዝቢ ዋህዮታት ክንትንትን የኽእለና፣ እዚ ድማ ካብ ዓበይቲ ናሙናታት ክትገብሮ ዘይከኣል እዩ። ነዚ ፕሮቶኮል ብምጥቃም፡ l-kynurenineን adenosineን፡ እዞም ክልተ ጽቡቕ መለለዪ ዘለዎም immunosuppressive metabolites ኣብ tumor T cells ወይ tumor cells ልዑል ምዃኑ ወሲንና (ስእሊ S3, B and C)። ስለዚ እዞም ውጽኢታት እዚኦም፡ ቴክኖሎጂ ምፍላይ ዋህዮታትናን ማስ ስፔክትሮሜትሪን ኣብ ቲሹታት ሕሙማት ብስነ-ህይወት ኣገደስቲ ዝኾኑ መተቦላይት ንምርካብ ዘለዎ ተኣማንነትን ዓቕምን ዘርእዩ እዮም።
ትንታነና እውን ኣብ ውሽጢን ኣብ መንጎን ሕሙማት ሓያል ናይ መቦሊክ ምፍልላይ ዓይነታት ዋህዮታት ከምዘርኣየ እዩ (ስእሊ 2Dን ስእሊ S4Aን)። ብፍላይ ምስ ካልኦት ሕሙማት ክነጻጸር እንከሎ፡ ሕሙም 70 ዝተፈላለየ ናይ ምምሕያሽ ባህርያት ኣርእዩ (ስእሊ 2Eን ስእሊ S4Bን)፡ እዚ ድማ ኣብ መንጎ ሕሙማት ርኡይ ምትሕውዋስ መግቢ ክህሉ ከም ዝኽእል የመልክት። ምስ ካልኦት ሕሙማት (ካብ 1.2 ክሳብ 2 ሊትሮ፤ ሰሌዳ S1) ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብ ሕሙማት 70 (80 ሚሊ ሊትር) ዝተኣከበ ጠቕላላ መጠን ኣሲት ዝነኣሰ ምዃኑ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ። ኣብ እዋን ትንተና ዋና ባእታታት ዝግበር ምቁጽጻር ኣብ መንጎ ሕሙማት ዘይምስምማዕ (ንኣብነት፡ ከፊላዊ ትንተና ተደራራቢ ምጥቃም) ኣብ መንጎ ዓይነታት ዋህዮታት ቅኑዕ ለውጢ የርኢ፣ ዓይነታት ዋህዮታትን/ወይ ማይክሮ ከባቢን ድማ ብመሰረት ፕሮፋይል መተቦላይት ብንጹር ተጠርኒፎም ኣለዉ (ስእሊ 2F)። ትንተና ንጽል መተቦላይት ነዞም ጽልዋታት ዘጉልሕ ኮይኑ፡ ኣብ መንጎ ዓይነታት ዋህዮታትን ማይክሮ ከባብን ርኡይ ፍልልይ ከምዘሎ ኣረጋጊጹ። ኣብዚ ክፍለጥ ዘለዎ፡ እቲ ኣዝዩ ጽንኩር ፍልልይ ዝተዓዘብናዮ MNA ኮይኑ፡ መብዛሕትኡ ግዜ ኣብ CD45- ዋህዮታትን ኣብ CD4+ን CD8+ን ዋህዮታት ናብቲ ሕበጥ ዝሰልጠፈን ዝሃብተመ እዩ (ስእሊ 3ሀ)። ንዋህዮታት CD4 + እዚ ጽልዋ እዚ ዝያዳ ርኡይ ኮይኑ፡ ኣብ ዋህዮታት CD8 + ዘሎ MNA እውን ብኣከባቢ ብሓያል ጽልዋ ዝተጸልወ ይመስል። ይኹን እምበር እዚ ኣገዳሲ ኣይኮነን፣ ምኽንያቱ ካብቶም ሽዱሽተ ሕሙማት እቶም ሰለስተ ጥራይ እዮም ንናይ ሕበጥ CD8+ ነጥብታት ክግምገሙ ዝኽእሉ። ብዘይካ MNA ኣብ ዝተፈላለዩ ዓይነታት ዋህዮታት ኣብ ኣሲትስን ሕበጥን ካልኦት ኣብ TIL ድኹም መለለዪ ዘለዎም መተቦላይት እውን ብፍልልይ ሃብታማት እዮም (ስእልታት S3ን S4ን)። ስለዚ እዞም መረዳእታታት ንተወሳኺ ምርምር ተስፋ ዘለዎም ስብስብ ኢሚዩኖሞዱላቶሪ ሜታቦላይት የቃልዑ።
(ሀ) ንቡር ዝኾነ ትሕዝቶ MNA ኣብ CD4+, CD8+ን CD45- ዋህዮታት ካብ ኣሲትስን ሕበጥን። እቲ ናይ ሳጹን ፕሎት ሚድያን (መስመር)፣ ኢንተርኳርታይል ሬንጅ (ፍሬም ሂንጅ)ን ዳታ ሬንጅን ዘርኢ ኮይኑ፡ ክሳብ 1.5 ዕጽፊ ናይቲ ኢንተርኳርታይል ሬንጅ (ፍሬም ዊስከር) እዩ። ከምቲ ኣብ ንዋትን ኣገባባትን ሕሙማት ተገሊጹ ዘሎ፡ ናይቲ ሕሙም ሊማ ዋጋ ተጠቒምካ ንP ዋጋ (*P<0.05 and **P<0.01) ምውሳን። (B) ስኬማዊ ስእላዊ ስእሊ ናይ MNA ሜታቦሊዝም (60)። ሜታቦላይትስ፡ ኤስ-ኣዴኖሳይል-1-ሜቲዮኒን፤ SAH, S-ኣዴኖሳይን-1-ሆሞሲስተይን፤ ኤን.ኤ.፡ ኒኮቲናማይድ፤ MNA, 1-ሜቲልኒኮቲናማይድ፤ 2-ፒዋይ፣ 1-ሜቲል- 2-ፒሪዶን-5-ካርቦክሳማይድ፤ 4-ፒዋይ፣ 1-ሜቲል-4-ፒሪዶን-5-ካርቦክሳማይድ፤ NR, ኒኮቲናማይድ ራይቦስ፤ NMN, ኒኮቲናማይድ ሞኖኑክሊዮታይድ። ኢንዛይማት (ቀጠልያ)፦ ኤንኤንኤምቲ፣ ኒኮቲናማይድ ኤን-ሜቲልትራንስፈረዝ፤ SIRT፣ ሰርቱይን፤ NAMPT, ኒኮቲናማይድ ፎስፎሪቦሳይል ትራንስፈረዝ፤ AOX1, ኣልደሃይድ ኦክሳይድ 1፤ NRK, ኒኮቲናማይድ ራይቦሳይድ ቃይነዝ፤ NMNAT, ኒኮቲናማይድ ሞኖ ኒውክሊዮታይድ ኣዴኒሌት ትራንስፈረዝ፤ Pnp1, ፒዩሪን ኒውክሊዮሳይድ ፎስፎርላይዝ። (C) t-SNE ናይ scRNA-seq ናይ ascites (ግራጭ)ን ሕበጥን (ቀይሕ፤ n = 3 ሕሙማት)። (D) NNMT መግለጺ ኣብ ዝተፈላለዩ ዋህዮታት ህዝቢ scRNA-seq ተጠቒሞም ዝተለለዩ። (E) መግለጺ NNMTን AOX1ን ኣብ SK-OV-3፣ ናይ ሰብ ድቂ ኩሊት (HEK) 293T፣ T ዋህዮታትን ብMNA ዝተሓከሙ T ዋህዮታትን። እቲ ዝተዓጽፈ መግለጺ ብተዛማዲ ምስ SK-OV-3 ተገሊጹ ኣሎ። እቲ ናይ መግለጺ ቅዲ ምስ SEM ተገሊጹ ኣሎ (n = 6 ጥዑያት ለገስቲ)። ካብ 35 ንላዕሊ ዝኾኑ Ct ዋጋታት ከም ዘይፍለጡ (UD) ይቑጸሩ። (F) መግለጺ SLC22A1ን SLC22A2ን ኣብ SK-OV-3, HEK293T, T ዋህዮታትን T ዋህዮታትን ብ8mM MNA ዝተሓከሙ። እቲ ዝተዓጽፈ መግለጺ ብተዛማዲ ምስ SK-OV-3 ተገሊጹ ኣሎ። እቲ ናይ መግለጺ ቅዲ ምስ SEM ተገሊጹ ኣሎ (n = 6 ጥዑያት ለገስቲ)። ካብ 35 ንላዕሊ ዝኾኑ Ct ዋጋታት ከም ዘይፍለጡ (UD) ይቑጸሩ። (G) ትሕዝቶ ዋህዮ MNA ኣብ ንጡፋት ጥዑያት ለጋሲ T ዋህዮታት ድሕሪ 72 ሰዓታት ምስ MNA ምሕቃቕ። እቲ ናይ መግለጺ ቅዲ ምስ SEM ተገሊጹ ኣሎ (n = 4 ጥዑያት ለገስቲ)።
MNA ነቲ ሜቲል ጉጅለ ካብ S-adenosyl-1-methionine (SAM) ናብ ኒኮቲናማይድ (NA) ብኒኮቲናማይድ N-methyltransferase (NNMT; ስእሊ 3B) ብምስግጋር ይፍጠር። NNMT ኣብ ዝተፈላለዩ መንሽሮታት ደቂ ሰባት ካብ መጠን ንላዕሊ ዝግለጽ ኮይኑ ምስ ምብዛሕ፣ ወራርን ሜታስታሲስን ዝተኣሳሰር እዩ (25-27)። ምንጪ MNA ኣብ T ዋህዮታት ኣብ TME ብዝበለጸ ንምርዳእ፡ ኣብ ascitesን ሕበጥን ሰለስተ HGSC ሕሙማት (ሰንጠረዥ S5) መግለጺ NNMT ኣብ መላእ ዓይነታት ዋህዮታት መለለዪ ንምሃብ scRNA-seq ተጠቒምና። ትንተና ኣስታት 6,500 ዋህዮታት ኣብ ከባቢታት ኣሲትስን ሕበጥን፡ መግለጺ NNMT ኣብቲ ዝግመት ህዝቢ ፋይብሮብላስትን ዋህዮታት ሕበጥን ዝተሓጽረ ምዃኑ ኣረጋጊጹ (ስእሊ 3፡ Cን Dን)። ኣብ ዝኾነ PTPRC (CD45 +) ዝገልጽ ህዝቢ ርኡይ መግለጺ NNMT ከምዘየለ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ (ስእሊ 3Dን ስእሊ S5Aን)፣ እዚ ድማ ኣብ መተቦላይት ስፔክትረም ዝተረኽበ MNA ናብ ዋህዮታት T ከምዝተኣታተወ ዘመልክት እዩ። መግለጺ ኣልደሃይድ ኦክሳይድ 1 (AOX1) ንኤምኤንኤ ናብ 1-ሜቲል-2-ፒሪዶን-5-ካርቦክሳማይድ (2-PYR) ወይ 1-ሜቲል-4-ፒሪዶን-5-ካርቦክሳማይድ (4- PYR) ይቕይሮ፤ ስእሊ 3B) እውን ኣብ ህዝቢ COL1A1 ዝገልፁ ፋይብሮብላስትስ ዝተሓፀረ እዩ (ስእሊ S5A)፣ እዚኦም ብሓባር ዋህዮታት ቲ ናይ ልምዳዊ ምትሕልላፍ ምግቢ MNA ዓቕሚ ከምዘይብሎም ዘመልክቱ እዮም። ናይዞም ምስ MNA ዝተኣሳሰሩ ጂናት መግለጺ ቅዲ ካብ ascites ካብ HGSC ሕሙማት ካልኣይ ነጻ ዋህዮ ዳታ ስብስብ ተጠቒምካ ተረጋጊጹ (ስእሊ S5B; n = 6) (16)። ብተወሳኺ፡ ብMNA ዝተሓከሙ ጥዑያት ለጋሲ T ዋህዮታት ብዝሒ ፖሊሜረዝ ሰንሰለታዊ ምላሽ (qPCR) ትንተና ምስ ቁጽጽር SK-OV-3 ዋህዮታት ሕበጥ ማህጸን ክነጻጸር እንከሎ፡ NNMT ወይ AOX1 ዳርጋ ከምዘይተገልጸ ኣርእዩ (ስእሊ 3E)። እዞም ዘይተጸበናዮ ውጽኢት ከም ዘመልክትዎ፡ MNA ካብ ፋይብሮብላስት ወይ ሕበጥ ናብ ተቐራረብቲ ዋህዮታት T ኣብ TME ክፍኖ ይኽእል።
ሕጹያት ስድራቤት ኦርጋኒክ ካቲዮን መጓዓዝያታት 1 ክሳብ 3 (OCT1, OCT2 and OCT3) ብፍሉይ ተሸካሚ 22 (SLC22) ስድራቤት (SLC22A1, SLC22A2 and SLC22A3) ዝተመዝገቡ እኳ እንተኾኑ፡ እቶም ክኾኑ ዝኽእሉ መጓዓዝያታት MNA ጌና ኣይተገልጹን (28) ። QPCR ናይ mRNA ካብ ጥዑያት ለገስቲ T ዋህዮታት ትሑት ደረጃ መግለጺ SLC22A1 ግን ከኣ ዘይርአ ደረጃ SLC22A2 ኣርእዩ፡ እዚ ድማ ቅድሚ ሕጂ ኣብ ጽሑፋት ከም ዝተጸብጸበ ኣረጋጊጹ (ስእሊ 3F) (29)። ብኣንጻሩ፡ መስመር ዋህዮታት ሕበጥ ማህጸን SK-OV-3 ልዑል ደረጃ ናይ ክልቲኦም መጓዓዝያታት ገሊጹ (ስእሊ 3F)።
ዋህዮታት ቲ ናይ ወጻኢ MNA ናይ ምምጣጥ ዓቕሚ ክህልዎም ዝኽእል ተኽእሎ ንምፍታን፡ ጥዑያት ለገስቲ ዋህዮታት ቲ ዝተፈላለየ ትሕዝቶ MNA ኣብ ዘለዎ ን72 ሰዓታት ባህሊ ተገይሩሎም። ኤክዞጀናዊ MNA ኣብ ዘይብሉ ዋህዮኣዊ ትሕዝቶ MNA ክፍለጥ ኣይክእልን (ስእሊ 3G)። ይኹን እምበር፡ ብኤክዞጀነስ MNA ዝተሓከሙ ንጡፋት ዋህዮታት ቲ፡ ኣብቶም ዋህዮታት ኣብ ልዕሊ ዓቐን ዝተመርኮሰ ወሰኽ ትሕዝቶ MNA ኣርእዮም፡ ክሳብ 6 ሚሊ ሜተር MNA (ስእሊ 3G)። እዚ ውጽኢት ከም ዘመልክቶ፡ ዋላ’ኳ ትሑት ደረጃ መግለጺ መጓዓዓዚን ንውሽጣዊ ዋህዮኣዊ ምትሕልላፍ MNA ሓላፍነት ዝስከም ቀንዲ ኢንዛይምን እንተሃለወ፡ TIL ግን ሕጂ’ውን MNA ክወስድ ይኽእል።
ኣብ ዋህዮታት ቲ ሕሙማት ዝርከብ ስፔክትረም መተቦላይትስን ኣብ ውሽጢ መርመራታት ምምጣጥ MNAን ምስ መንሽሮ ዝተኣሳሰሩ ፋይብሮብላስትስ (CAF) MNA ናይ ምፍሳስ ተኽእሎኦም ይውስኽን ዋህዮታት ሕበጥ ንፊኖታይፕን ስራሕን TIL ክቆጻጸሩ ይኽእሉ። ጽልዋ MNA ኣብ ዋህዮታት T ንምፍላጥ፡ ጥዑያት ለጋሲ ዋህዮታት T ኣብ ህላወ ወይ ኣብ ዘይብሉ MNA ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ተነቒሎም፡ ምብዛሖምን ምፍራይ ሳይቶኪንን ተገምጊሙ። ድሕሪ 7 መዓልታት MNA ኣብ ዝለዓለ መጠን ምውሳኽ፡ ቁጽሪ ዕጽፊ ህዝቢ ብማእከላይ ደረጃ ክጎድል እንከሎ፡ ኣብ ኩሉ ዶዝ ድማ ብርታዐ ተዓቂቡ (ስእሊ 4ሀ)። ብተወሳኺ፡ ሕክምና ኤክዞጀናዊ MNA፡ ብዝሒ ናይቶም ቲሞር ኔክሮሲስ ፋክተር-α (TNFα; ስእሊ 4B) ዝገልጹ CD4 +ን CD8 + T ዋህዮታት ከም ዝውስኽ ገይሩ። ብኣንጻሩ፡ ኣብ ውሽጢ ዋህዮታት ምፍራይ IFN-γ ኣብ ዋህዮታት CD4 + T ብዓቢኡ ክጎድል እንከሎ፡ ኣብ ዋህዮታት CD8 + T ግን ኣይነከየን፡ ኣብ ኢንተርሉኪን 2 ድማ ርኡይ ለውጢ ኣይተራእየን (IL-2፤ ስእሊ 4፡ Cን Dን)። ስለዚ፡ ካብዞም ብMNA ዝተሓከሙ ባህልታት ዋህዮታት ቲ፡ ብኢንዛይም ዝተኣሳሰረ ኢሙኖሶርበንት መርመራ (ELISA) ልዕለ-ነጥብታት፡ ኣብ TNFα ርኡይ ወሰኽ፡ ምንካይ IFN-γ፡ ከምኡ’ውን ኣብ IL-2 ዝኾነ ለውጢ ኣርእዩ (ስእሊ 4፡ ካብ E ክሳብ G)። . ምንካይ IFN-γ MNA ንጸረ-ሕበጥ ንጥፈታት ዋህዮታት T ኣብ ምዕጋት ተራ ክጻወት ከም ዝኽእል የመልክት። MNA ኣብ T cell-mediated cytotoxicity ዘለዎ ጽልዋ ንምምሳል፡ ብቐጠልያ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (GFP) -CAR-T) ዋህዮታት ዝምራሕ ፎሌት ተቐባሊ αን CAR-T (GFP)ን ዝዓለሙ ዋህዮታት ቺመሪክ ኣንቲጀን ተቐባሊ T (FRα-CAR-T) ብጥዑያት ለጋሲ ዙርያዊ ደም ሞኖኑክለር ዋህዮታት (PBMC) ይፍረዩ። ዋህዮታት CAR-T ን24 ሰዓታት ኣብ ህላወ MNA ተዓብሊሎም፣ ድሕሪኡ ምስቶም ፎሌት ተቐባሊ α ዝገልጹ ናይ ሰብ SK-OV-3 ዋህዮታት ሕበጥ ማህጸን ብ10:1 ብዝኾነ ሬሽዮ effector to target ተሓቢኦም። MNA ሕክምና ውጽኢቱ ናይ FRα-CAR-T ዋህዮታት ናይ ምቕታል ንጥፈት ርኡይ ምንካይ ከምዘርኣየ ኮይኑ፡ እዚ ድማ ምስቶም ብኣዴኖሲን ዝተሓከሙ FRα-CAR-T ዋህዮታት ዝመሳሰል እዩ ነይሩ (ስእሊ 4H)።
(ሀ) ጠቕላላ ቁጽሪ ህያዋን ዋህዮታትን ዕጽፊ ህዝብን (PD) ብቐጥታ ካብ ባህሊ ኣብ መዓልቲ 7. እቲ ባር ግራፍ ንማእከላይ + SEM ናይ ሽዱሽተ ጥዑያት ለገስቲ ይውክል። ካብ ብውሑዱ n = 3 ነጻ ፈተነታት ዝተረኽበ መረዳእታ ይውክል። (B to D) CD3/CD28ን IL-2ን ንዋህዮታት T ኣብ ነፍሲ ወከፎም MNA ትሕዝቶ ን7 መዓልታት ንምንቅስቓስ ተጠቒሞም። ቅድሚ ትንተና ዋህዮታት ብፒኤምኤ/ኣዮኖማይሲን ብጎልጂስቶፕ ን4 ሰዓታት ተነቓቒሖም። TNFα (B) መግለጺ ኣብ ዋህዮታት T። ኣብነት ምስሊ (ጸጋም)ን ሰንጠረዥ ዳታ (የማን)ን መግለጺ TNFα ኣብ ህያዋን ዋህዮታት። IFN-γ (C)ን IL-2 (D)ን መግለጺ ኣብ ዋህዮታት T። መግለጺ ሳይቶካይን ብፍሎው ሳይቶሜትሪ ተለኪዑ። እቲ ባር ግራፍ ንማእከላይ ገምጋም (n = 6 ጥዑያት ለገስቲ) + SEM ይውክል። ንP ዋጋ ንምውሳን ሓደ ኣንፈት ትንተና ፍልልይን ተደጋጋሚ መለክዒታትን (*P<0.05ን **P<0.01ን) ምጥቃም። ካብ ብውሑዱ n = 3 ነጻ ፈተነታት ዝተረኽበ መረዳእታ ይውክል። (E to G) CD3/CD28ን IL-2ን ንዋህዮታት T ኣብ ነፍሲ ወከፎም ትሕዝቶ MNA ን7 መዓልታት ንምንቅስቓስ ተጠቒሞም። እቲ ማእከላይ ቅድሚን ድሕሪን 4 ሰዓታት PMA/ionomycin ምልዕዓል ተኣኪቡ። ትሕዝቶ TNFα (E)፣ IFN-γ (F)ን IL-2 (G)ን ብELISA ተለኪዑ። እቲ ባር ግራፍ ንማእከላይ (n = 5 ጥዑያት ለገስቲ) + SEM ይውክል። P ዋጋ ብሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይን ተደጋጋሚ መለክዒታትን (*P<0.05) ተጠቒምካ ዝተወሰነ። እቲ ነጥቢ ዘለዎ መስመር ናይቲ ምልላይ ደረት ምልላይ የመልክት። (H) መርመራ ምፍሳስ ዋህዮታት። FRα-CAR-T ወይ GFP-CAR-T ዋህዮታት ብኣዴኖሳይን (250μM) ወይ MNA (10 mM) ን24 ሰዓታት ተስተኻኺሎም፣ ወይ ድማ ከይተሓከሙ (Ctrl) ተገዲፎም። ሚእታዊት ቅትለት ዋህዮታት SK-OV-3 ተለኪዑ። P ዋጋ ብ Welch t test (*P<0.5 and **P<0.01) ዝተወሰነ።
ብዛዕባ MNA-ዝምርኮስ TNFα መግለጺ ምቁጽጻር መካኒካዊ ርድኢት ንምርካብ፡ ኣብ TNFα mRNA ናይ MNA ዝተሓከሙ T ዋህዮታት ዝመጽእ ለውጢ ተገምጊሙ (ስእሊ 5A)። ብMNA ዝተሓከሙ ጥዑያት ለጋሲ T ዋህዮታት ኣብ ደረጃታት ትራንስክሪፕሽን TNFα ብኽልተ ዕጽፊ ወሰኽ ከምዘርኣዩን፡ እዚ ድማ MNA ኣብ ምቁጽጻር ትራንስክሪፕሽን TNFα ከምዝምርኮስ የመልክት። ነዚ ክኸውን ዝኽእል ምቁጽጻራዊ ኣገባብ ንምምርማር፡ ክልተ ፍሉጣት ትራንስክሪፕሽን ረቛሒታት ንTNFα ዝቆጻጸሩ፡ ማለት ኣክቲቬትድ ቲ ሴል ኒዩክለር ፋክተር (NFAT)ን ፍሉይ ፕሮቲን 1 (Sp1)ን፡ ንMNA ምትእስሳር ምስ ፕሮክሲማል TNFα ፕሮሞተር ምላሽ ሂቦም ተገምጊሞም ( 30 ). እቲ TNFα ፕሮሞተር 6 ዝተለለዩ NFAT መእሰሪ ቦታታትን 2 Sp1 መእሰሪ ቦታታትን ዝሓዘ ኮይኑ፡ ኣብ ሓደ ቦታ [-55 base pairs (bp) from the 5'cap] (30) ተደራሪቡ። ክሮማቲን ኢሙኖፕረሲፒቴሽን (ChIP) ብMNA ክሕከም ከሎ ምትእስሳር Sp1 ምስ TNFα ፕሮሞተር ብሰለስተ ዕጽፊ ከምዝውስኽ ኣርእዩ። ምውህሃድ ኤንኤፍኤቲ እውን እናወሰኸን ኣገዳስነቱ ቀሪቡን (ስእሊ 5ለ)። እዞም መረዳእታታት ከም ዘመልክትዎ፡ MNA ብመገዲ Sp1 ትራንስክሪፕሽን ንመግለጺ TNFα ከም ዝቆጻጸር፡ ብውሑድ ደረጃ ድማ ንመግለጺ NFAT ከም ዝቆጻጸር ይሕብሩ።
(ሀ) ምስቶም ብዘይ MNA ዝተባህለ ዋህዮታት ቲ ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብቶም ብኤምኤንኤ ዝተሓከሙ ዋህዮታት ቲ ዝረአ ናይ ዕጽፊ ለውጢ መግለጺ TNFα። እቲ ናይ መግለጺ ቅዲ ምስ SEM ተገሊጹ ኣሎ (n = 5 ጥዑያት ለገስቲ)። ካብ ብውሑዱ n = 3 ነጻ ፈተነታት ዝተረኽበ መረዳእታ ይውክል። (B) ድሕሪ NFATን Sp1ን ብ8 mM MNA ወይ ብዘይ 8 mM MNA ዝተሓከሙ T ዋህዮታት TNFα ፕሮሞተር ምስ (Ctrl)ን PMA/ionomycin stimulationን ን4 ሰዓታት ተደሚሩ። ኢሙኖግሎቡሊን G (IgG)ን H3ን ከም ኣሉታዊን ኣወንታዊን ቁጽጽር ንኢሙኖፕረሲፒቴሽን ብቕደም ተኸተል ተጠቒሞም። ብዝሒ ChIP ኣብ MNA ዝተሓከሙ ዋህዮታት ምትእስሳር Sp1ን NFATን ምስ TNFα ፕሮሞተር ምስቲ ቁጽጽር ክነጻጸር እንከሎ ብብዙሕ ዕጽፊ ከምዝወሰኸ ኣርእዩ። ካብ ብውሑዱ n = 3 ነጻ ፈተነታት ዝተረኽበ መረዳእታ ይውክል። ብብዙሕ t-tests ዝተወሰነ P ዋጋ (*** P <0.01)። (C) ምስ ascites ናይ HGSC ክነጻጸር እንከሎ፡ T cells (non-cytotoxic) ኣብቲ ሕበጥ ምውሳኽ መግለጺ TNF ኣርእዮም። እቶም ሕብርታት ንዝተፈላለዩ ሕሙማት ይውክሉ። እቶም ዝተርኣዩ ዋህዮታት ብዘይተሓሰበ መንገዲ ናብ 300 ናሙና ተወሰደሎምን ልዕሊ ዓቐን ስሕበት ንምግዳብ ጂተር ተገይሮምን እዮም (** Padj = 0.0076)። (D) ንመንሽሮ ማህጸን ዝቐረበ ሞዴል MNA። MNA ኣብ ዋህዮታት ሕበጥ ኣብ TME ድማ ኣብ ፋይብሮብላስት ዝፍጠር ኮይኑ ብዋህዮታት T ይውሰድ። MNA ምትእስሳር Sp1 ምስ TNFα ፕሮሞተር ይውስኽ፣ እዚ ድማ ናብ ምውሳኽ TNFα ትራንስክሪፕሽንን ምፍራይ TNFα ሳይቶኪንን የስዕብ። MNA ውን ምጉዳል IFN-γ የስዕብ። ምዕጋት ስራሕ ዋህዮታት ቲ ናይ ምቕታል ዓቕሚ ምጉዳልን ምቅልጣፍ ዕብየት ሕበጥን የስዕብ።
ብመሰረት ጸብጻባት፡ TNFα ኣብ ቅድሚትን ድሕሪትን ዝምርኮስ ጸረ-ሕበጥን ጸረ-ሕበጥን ጽልዋታት ኣለዎ፡ እንተኾነ ግን ንዕብየትን ሜታስታሲስን መንሽሮ ማህጸን ኣብ ምድንፋዕ ፍሉጥ ተራ ኣለዎ (31-33)። ብመሰረት ጸብጻባት፡ ኣብ መንሽሮ ማህጸን ዘለዎም ሕሙማት፡ ኣብ ኣሲትስን ቲሹታት ሕበጥን ዝርከብ ትሕዝቶ TNFα ካብቲ ኣብ ጽቡቕ ቲሹታት ዘሎ ዝለዓለ እዩ (34-36)። ብመንጽር ኣገባብ፡ TNFα ንኣክቲቬሽን፡ ስራሕን ምብዛሕን ዋህዮታት ጻዕዳ ደም ክቆጻጸር ይኽእል፡ ከምኡ’ውን ንፊኖታይፕ ዋህዮታት መንሽሮ ክቕይር ይኽእል (37, 38)። ምስዞም ርኽበታት ዝሰማማዕ፡ ፍልልያዊ ጂን መግለጺ ትንተና፡ TNF ኣብ ዋህዮታት T ኣብ ቲሹታት ሕበጥ ምስ ኣሲትስ ክነጻጸር እንከሎ ብዓቢኡ ንላዕሊ ከምዝተመሓደረ ኣርእዩ (ስእሊ 5C)። ምውሳኽ መግለጺ TNF ኣብቶም ዘይ-ሳይቶቶክሲክ ፊኖታይፕ ዘለዎም ህዝቢ ዋህዮታት T ጥራይ እዩ ተራእዩ (ስእሊ S5A)። ብሓፈሻ እዞም መረዳእታታት እዚኦም MNA ኣብ HGSC ድርብ ኢሚዩኖሱፕረሲቭን ሕበጥ ዘተባብዕን ውጽኢት ኣለዎ ዝብል ኣረኣእያ ይድግፉ።
ኣብ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ዝተመርኮሰ ፍሎረሰንት ምልክት ምግባር ንመጽናዕቲ ምትሕልላፍ መግቢ TIL ቀንዲ ሜላ ኮይኑ ኣሎ። እዞም መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ፡ ምስ ዙርያዊ ደም ሊምፎሳይት ወይ ቲ ሴላት ካብ ካልኣዊ ሊምፎይድ ኣካላት ክነጻጸሩ ከለዉ፡ ናይ ኣንጭዋን ሰብን TIL ዝለዓለ ዝንባለ ናይ ምውሳድ ግሉኮስ (4, 39) ከምኡ’ውን ቀስ ብቐስ ናይ ማይቶኮንድርያል ስራሕ ምጥፋእ (19, 40) ከም ዘለዎም ኣረጋጊጾም። ኣብዚ መጽናዕቲ ተመሳሳሊ ውጽኢት እኳ እንተተዓዘብና፡ እቲ ቁልፊ ምዕባለ ግን ካብ ሓደ ዝተቖርጸ ቲሹ ሕበጥ ንዝመጽእ ምትሕልላፍ ዋህዮታት ሕበጥን TILን ምውድዳር እዩ። ምስ ገለ ካብዞም ቅድሚ ሕጂ ዝተገብረ ጸብጻባት ዝሰማማዕ፡ ካብ ኣሲትስን ሕበጥን ዝመጹ ዋህዮታት ሕበጥ (CD45-EpCAM +) ካብ ዋህዮታት CD8 +ን CD4 +ን T ዝለዓለ ምውሳድ ግሉኮስ ኣለዎም፡ እዚ ድማ ልዑል ምውሳድ ግሉኮስ ዋህዮታት ሕበጥ ምስ ዋህዮታት T ክነጻጸር ከም ዝኽእል ይድግፍ። ኣምር ውድድር ዋህዮታት ቲ። TME. ይኹን እምበር ንጥፈት ማይቶኮንድርያል ዋህዮታት ሕበጥ ካብ ናይ CD8 + T ዋህዮታት ዝለዓለ እኳ እንተኾነ ንጥፈት ማይቶኮንድርያል ግን ምስ ናይ CD4 + T ዋህዮታት ዝመሳሰል እዩ። እዞም ውጽኢታት ነቲ ዝቕልቀል ዘሎ ቴማ፡ ኦክሲዳቲቭ ሜታቦሊዝም ንዋህዮታት ሕበጥ ኣገዳሲ ምዃኑ የደልድሉ (41, 42)። ብተወሳኺ ዋህዮታት CD8 + T ካብ ዋህዮታት CD4 + T ንላዕሊ ንኦክሲዳቲቭ ምዝንባዕ ተቓላዕቲ ክኾኑ ከምዝኽእሉ ወይ ድማ ዋህዮታት CD4 + T ንጥፈታት ማይቶኮንድርያ ንምዕቃብ ካብ ግሉኮስ ወጻኢ ካልእ ምንጪ ካርቦን ክጥቀሙ ከምዝኽእሉ ይሕብሩ (43, 44)። ኣብ መንጎ CD4 + T effectors, T effector memoryን T central memory cellsን ኣብ ascites ኣብ ምውሳድ ግሉኮስ ወይ ማይቶኮንድርያል ንጥፈት ፍልልይ ከምዘይተዓዘብና ክፍለጥ ይግባእ። ብተመሳሳሊ፡ ኣብ ሕበጥ ዝርከቡ ዋህዮታት CD8 + T ናይ ምፍልላይ ኩነታት ምስ ለውጢ ምውሳድ ግሉኮስ ዝኾነ ርክብ የብሉን፡ እዚ ድማ ኣብ መንጎ ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ዝተባህለ ዋህዮታት Tን ኣብ ውሽጢ ሰብነት (in vivo) ዝተባህለ ሰብኣዊ TILን ዘሎ ርኡይ ፍልልይ የጉልሕ (22)። እዚ ትዕዝብትታት ብዘይሻራዊ ኣውቶማቲክ ምምቕራሕ ህዝቢ ዋህዮታት ምጥቃም እውን ተረጋጊፁ እዩ፣ እዚ ድማ ብተወሳኺ ካብ ዋህዮታት ሕበጥ ዝለዓለ ምውሳድ ግሉኮስን ንጥፈት ማይቶኮንድርያልን ዘለዎም ዋህዮታት CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ስፍሕ ዝበለ ኮይኖም ግን ድማ Metabolic active cell population ከምዘለዎም ኣረጋጊፁ። እዚ ህዝቢ እዚ ነቲ ኣብ scRNA-seq ትንተና ዝተለለየ ግምታዊ ንኡስ ህዝቢ ማይሎይድ ሳፕረሰር ዋህዮታት ወይ ፕላዝማሳይቶይድ ደንድሪቲክ ዋህዮታት ክውክል ይኽእል። እዚኦም ክልቲኦም ኣብ ሕበጥ ማህጸን ደቂ ሰባት [45] እኳ እንተተገልጹ፡ ገና የድልዮም ተወሳኺ ስራሕ ነዚ ማይሎይድ ንኡስ ህዝቢ ምግላጽ እዩ።
ዋላ እኳ ኣብ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ዝተመርኮሰ ኣገባባት ኣብ መንጎ ዓይነታት ዋህዮታት ዘሎ ሓፈሻዊ ፍልልይ ግሉኮስን ኦክሲዳቲቭ ሜታቦሊዝምን ከነጽር እንተኸኣለ፡ ኣብ TME ንዝፍጠር ማይቶኮንድርያል ሜታቦሊዝም ብግሉኮስ ወይ ካልእ ምንጪ ካርቦን ዝፍጠር ልክዕ መተቦላይት ግን ገና ኣይተወሰነን። ህላወ ወይ ዘይምህላው መተቦላይት ናብ ዝተዋህበ ንኡስ ጕጅለ TIL ምምዳብ ካብቲ ዝተቖርጸ ቲሹ ናይቲ ዋህዮ ህዝቢ ምጽራይ የድሊ። ስለዚ፡ ኣገባብ ምህብታም ዋህዮታትና ምስ ማስ ስፔክትሮሜትሪ ተደሚሩ፡ ኣብ ምትእስሳር ናሙናታት ሕሙማት ኣብ ዋህዮታት ቲን ህዝቢ ዋህዮታት ሕበጥን ብፍልልይ ዝሃብተሙ መተቦላይትስ ርድኢት ክህብ ይኽእል። እዚ ኣገባብ እዚ ካብ ብፍሎረሰንስ ዝንቀሳቐስ ምፍላይ ዋህዮታት ብልጫታት እኳ እንተሃለዎ፡ ገለ ቤተ-መጻሕፍቲ መተቦላይት ብሰንኪ ባህርያዊ ምርግጋእን/ወይ ቅልጡፍ ፍጥነት ምዝውዋርን ክጽለዉ ይኽእሉ (22)። እዚ ከምዚ ኢሉ እናሃለወ፡ እቲ ኣገባብና፡ ኣብ መንጎ ዓይነታት ናሙና ኣዝዮም ስለዝፈላለዩ፡ ክልተ ኣፍልጦ ዘለዎም ኢሚዩኖሱፕረሲቭ ሜታቦላይትስ፡ ኣዴኖሳይንን ኪኑረኒንን ከለሊ ክኢሉ።
ኣብ ልዕሊ ሕበጥን ንኡሳን ዓይነታት TILን ዝገበርናዮ ሜታቦኖሚክ ትንተና ብዛዕባ ተራ መተቦላይት ኣብ TME ማህጸን ዝያዳ ርድኢት ይህብ። መጀመርታ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ብምጥቃም ኣብ መንጎ ሕበጥን CD4 + T ዋህዮታትን ኣብ ንጥፈታት ማይቶኮንድርያ ፍልልይ ከምዘየለ ወሲንና። ይኹን እምበር፡ ትንተና LC-MS/MS ኣብ ብዝሒ መተቦላይት ኣብ መንጎ እዞም ህዝብታት ርኡይ ለውጢ ከምዘርኣየን፡ እዚ ድማ ብዛዕባ ምትሕልላፍ መግቢ TILን ሓፈሻዊ ንጥፈታቱን ዝግበር መደምደምታታት ጥንቁቕ ትርጉም ከምዘድልዮ ይሕብር። ካልኣይ፡ MNA ኣብ መንጎ CD45-cellsን T cellsን ኣብ ascites ዝዓበየ ፍልልይ ዘለዎ መተቦላይት እምበር ኣብ ሕበጥ ኣይኮነን። ስለዚ፡ ምክፍፋልን ኣቀማምጣ ሕበጥን ኣብ ምትሕልላፍ መግቢ TIL ዝተፈላለየ ጽልዋ ክህልዎ ይኽእል እዩ፡ እዚ ድማ ኣብ ሓደ ዝተዋህበ ማይክሮ ከባቢ ክህሉ ዝኽእል ዘይምስምማዕ የጉልሕ። ሳልሳይ፡ መግለጺ ናይቲ MNA ዘፍሪ ኢንዛይም NNMT ብቐንዱ ኣብ CAF ዝተሓጽረ ኮይኑ፡ እዚ ድማ ብውሑድ ደረጃ ዋህዮታት ሕበጥ ኮይኑ፡ ኣብ ሕበጥ ዝመጹ ዋህዮታት T ግን ክርአ ዝኽእል ደረጃታት MNA ይርአ። ልዕሊ ዓቐን ምግላጽ NNMT ኣብ ማህጸን CAF መንሽሮ ዘተባብዕ ውጽኢት ከምዘለዎ ዝፍለጥ ኮይኑ፡ ብኸፊል ብሰንኪ ምድንፋዕ ምትሕልላፍ መግቢ CAF፡ ወራር ሕበጥን ሜታስታሲስን እዩ (27)። ዋላ’ኳ ሓፈሻዊ ደረጃ TIL ማእከላይ እንተኾነ፡ መግለጺ NNMT ኣብ CAF ምስ ንኡስ ዓይነት መንሽሮ ጂኖም ኣትላስ (TCGA) መሰንከይማል ብቐረባ ዝተኣሳሰር ኮይኑ፡ እዚ ድማ ምስ ድኹም ትንበያ ዝተኣሳሰር እዩ (27, 46, 47)። ኣብ መወዳእታ፡ መግለጺ ናይቲ ንመበላሸዊ MNA ሓላፍነት ዝስከም ኢንዛይም AOX1 ኣብ ህዝቢ CAF ጥራይ ዝተሓጽረ ኮይኑ፡ እዚ ድማ ዋህዮታት T MNA ናይ ምትሕልላፍ ዓቕሚ ከምዘይብሎም የመልክት። እዞም ውጽኢታት ነዚ ርኽበት ንምርግጋጽ ተወሳኺ ስራሕ ዘድሊ እኳ እንተኾነ፡ ኣብ ዋህዮታት ቲ ልዑል መጠን MNA ምህላዉ፡ ህላወ ኢሚዩኖሱፕረሲቭ ሲኤኤፍ ማይክሮኢንቫይሮመንት ከመልክት ይኽእል እዩ ዝብል ሓሳብ ይድግፉ።
ትሑት ደረጃ መግለጺ መጓዓዝያታት MNAን ኣብ ምትሕልላፍ ምግቢ MNA ዝሳተፉ ቁልፊ ፕሮቲናት ዘይርአ ደረጃታትን ኣብ ግምት ብምእታው፡ ህላወ MNA ኣብ ዋህዮታት T ዘይተጸበናዮ እዩ። NNMT ይኹን AOX1 ብ scRNA-seq ትንተናን ዕላማ ዝገበረ qPCRን ናይ ክልተ ነጻ ጕጅለታት ክረኽብዎ ኣይከኣሉን። እዞም ውጽኢታት ከም ዘመልክትዎ፡ MNA ብT cells ዘይኮነስ ካብ ከባቢ TME ከም ዝምጠጥ ይሕብሩ። ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ዝተገብረ ፈተነታት ከም ዘመልክቶ፡ ዋህዮታት ቲ፡ ካብ ደገ ዝመጽእ MNA ናይ ምውህላል ዝንባለ ኣለዎም።
ኣብ ውሽጢ መርመራ ዝገበርናዮ መጽናዕትታት ከም ዘመልክቶ፡ ኤክዞጀነስ MNA ኣብ ዋህዮታት T ንመግለጺ TNFα ከም ዝድርኽን ምትእስሳር Sp1 ምስ TNFα ፕሮሞተር ከም ዘደንፍዕን ይሕብር። ዋላ እኳ TNFα ጸረ-ሕበጥን ጸረ-ሕበጥን ስራሕ እንተሃለዎ፡ ኣብ መንሽሮ ማህጸን፡ TNFα ንዕብየት መንሽሮ ማህጸን ከደንፍዕ ይኽእል (31-33)። ኣብ ባህሊ ዋህዮታት ሕበጥ ማህጸን TNFα ምውጋድ ወይ ኣብ ሞዴላት ኣንጭዋ ምልክት TNFα ምውጋድ TNFα-mediated inflammatory cytokine production ከማሓይሽን ዕብየት ሕበጥ ክዓግትን ይኽእል (32, 35)። ስለዚ ኣብዚ ጉዳይ እዚ፡ ካብ TME ዝተረኽበ MNA ብመንገዲ ኣውቶክራይን ሉፕ ኣቢሉ ብTNFα ዝምርኮስ ኣገባብ ከም ፕሮ-ኢንፍላማቶሪ መተቦላይት ክሰርሕ ይኽእል፡ በዚ ድማ ንኽስተትን ዝርግሐን መንሽሮ ማህጸን የደንፍዕ ( 31 ). ካብዚ ተኽእሎ መሰረት ብምግባር፡ ምዕጋት TNFα ንመንሽሮ ማህጸን ከም ፍወሳዊ መሳርሒ ኮይኑ ይጽናዕ ኣሎ (37, 48, 49)። ብተወሳኺ፡ MNA ንሳይቶቶክሲሲቲ ዋህዮታት CAR-T ናብ ዋህዮታት ሕበጥ ማህጸን የዳኽሞ፡ እዚ ድማ ብMNA ዝመሓላለፍ ምዕፋን ሕማም ምክልኻል ተወሳኺ መርትዖ ይህብ። እዞም ውጽኢታት ብሓባር፡ ሕበጥን ዋህዮታት CAFን MNA ናብ ውጽእ ዋህዮ TME ዝፍንዉሉ ሞዴል ይሕብሩ። ብመንገዲ (i) ብTNF-ዝተደረኸ ዕብየት መንሽሮ ማህጸንን (ii) MNA-induced T cell cytotoxic activity inhibitionን፡ እዚ ድርብ ውጽኢት ሕበጥ ክህልዎ ይኽእል (ስእሊ 5D)።
ኣብ መደምደምታ፡ እዚ መጽናዕቲ ውህደት ቅልጡፍ ምህብታም ዋህዮታት፡ ንጽል-ዋህዮ መስርዕን ምትሕውዋስ ፕሮፋይሊንግን ብምትግባር፡ ኣብ መንጎ ሕበጥን ዋህዮታት ኣሲትስን ኣብ ሕሙማት HGSC ዘሎ ዓቢ ኢሚዩኖሜታቦሎሚክ ፍልልይ ኣቃሊዑ። እዚ ኩለመዳያዊ ትንተና ኣብ መንጎ ዋህዮታት ቲ ኣብ ምውሳድ ግሉኮስን ንጥፈታት ማይቶኮንድርያን ፍልልያት ከምዘሎ ኣርእዩ፣ MNA ድማ ከም ዘይ-ዋህዮ ርእሱ ዝኸኣለ ናይ ሕማም ምክልኻል ተቖጻጻሪ መተቦላይት ኣለልዩ። እዚ ዳታታት እዚ፡ TME ኣብ መንሽሮታት ደቂ ሰባት ንመተቦሊዝም ዋህዮታት ቲ ብኸመይ ከም ዝጸልዎ ጽልዋ ኣለዎም። ኣብ መንጎ ዋህዮታት ቲን ዋህዮታት መንሽሮን ቀጥታዊ ውድድር መኣዛታት ከምዘሎ እንተተጸብጸበ፡ መተቦላይትስ ከም ዘይቀጥታዊ ተቖጻጸርቲ ኮይኖም ምዕባለ ሕበጥ ንምድንፋዕን ምናልባት’ውን ንውሽጣዊ ምላሽ ምክልኻል ሕማም ንምዕፋንን እውን ክዋስኡ ይኽእሉ። ተወሳኺ መግለጺ ተግባራዊ ተራ ናይዞም ተቖጻጸርቲ መተቦላይትስ፡ ነቲ ጸረ-ሕበጥ ናይ ምክልኻል ምላሽ ንምዕባይ ኣማራጺ ስትራተጂታት ክኸፍት ይኽእል።
መርመራታት ሕሙማትን ክሊኒካዊ መረዳእታን ብመንገዲ እቲ ብመኽዘን ቲሹ ካናዳ ዝተረጋገጸ መኽዘን ቲሹ መንሽሮ ቢሲ እዩ ተረኺቡ። ብመሰረት እቲ ብኮሚተ ስነ-ምግባር ምርምር መንሽሮ ቢሲን ዩኒቨርሲቲ ብሪቲሽ ኮሎምብያን (H07-00463) ዝጸደቐ ፕሮቶኮል፡ ኩሎም መርመራታትን ክሊኒካዊ መረዳእታታትን ሕሙማት ብሓበሬታ ዝተሰነየ ናይ ጽሑፍ ፍቓድ ዝረኸቡ ወይ ድማ ብወግዒ ፍቓዶም ዝገደፉ እዮም። እቶም ናሙናታት ኣብቲ ዝተረጋገፀ ባዮባንክ (BRC-00290) ይኽዘኑ። ዝርዝር ባህርያት ሕሙማት ኣብ ሰሌዳታት S1ን S5ን ተገሊጹ ኣሎ። ንክራይዮፕሪዘርቬሽን፡ ስካልፐል ተጠቒምካ ነቲ ናይቲ ሕሙም ናሙና ሕበጥ ብመካኒካዊ ኣገባብ ይበስብሶ፡ ድሕሪኡ ድማ ብ100 ማይክሮን ፍልተር ኣቢሉ ብምድፋእ ሓደ ዋህዮ ስንብራት ይረክብ። ናይቲ ሕሙም ኣሲትስ ብ1500 rpm ን10 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ብሴንትሪፉጅ ተገይሩ ነቶም ዋህዮታት ፔለት ብምግባርን ነቲ ኣብ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ንምእላይን ተገይሩ። ካብ ሕበጥን ኣሲትስን ዝተረኸቡ ዋህዮታት ኣብ 50% ብሙቐት ዘይተንቀሳቐሰ ሰብኣዊ ኤቢ ሴረም (ሲግማ-ኣልድሪች)፣ 40% RPMI-1640 (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ)ን 10% ዳይሜቲል ሳልፎክሳይድን ብክራዮፕሪዘርቭ ተገይሮም እዮም። እዞም ዝተዓቀቡ።
እቲ ምሉእ ማእከላይ 0.22 ማይክሮሜትር ዝተጻረየ 50:50 ዝተመላእ RPMI 1640: AimV ዝሓዘ እዩ። RPMI 1640 + 2.05 ሚሊ ሜትር l-ግሉታሚን (ተርሞ ፊሸር ሳይንሳዊ) ብ10% ብሙቐት ዘይተንቀሳቐሰ ሰብኣዊ ኤቢ ሴረም (ሲግማ-ኣልድሪች)፣ 12.5 ሚሊ ሜትር ሄፐስ (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ)፣ 2 ሚሊ ሜትር l-ግሉታሚን (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) ፊሸር ሳይንቲፊክ)፣ 1 x ፔኒሲሊን ስትረፕቶማይሲን (PenStrep) ፍታሕ (Thermo Fisher Scientific) ከምኡ’ውን 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) ብ20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)ን 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific)ን ይምለእ። እቲ ፍሎው ሳይቶሜተር ስቴይኒንግ መከላኸሊ 0.22μm ዝተፃረየ ፎስፌት መከላኸሊ ጨው (PBS; Invitrogen) ዝሓዘ ኮይኑ ብ3% ብሙቐት ዘይተንቀሳቐሰ ኤቢ ሰብኣዊ ሴረም (ሲግማ) ዝተመላእ እዩ። እቲ ናይ ዋህዮ ምህብታም መከላኸሊ ብ0.22μm ዝተጻረየ ፒቢኤስ ዝቖመ ኮይኑ ብ0.5% ብሙቐት ዘይተንቀሳቐሰ ሰብኣዊ ኤቢ ሴረም (ሲግማ-ኣልድሪች) ዝተመላእ እዩ።
ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምሉእ ማእኸላይ ዋህዮታት ብ10 nM MT DRን 100 μM 2-NBDGን ን30 ደቓይቕ ተለኺዮም እዮም። ቀጺሎም እቶም ዋህዮታት ብናይ ህይወት ቀለም eF506 ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን15 ደቓይቕ ተለኺዮም። እቶም ዋህዮታት ኣብ FC Block (eBioscience)ን Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)ን ዳግማይ ኣሰናቢድካ ኣብ ፍሎው ሳይቶሜተር ስቴይኒንግ ባፈር (ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ) ምቕልቃል፣ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን10 ደቓይቕ ምሕቃቕ። ነቶም ዋህዮታት ብስብስብ ጸረ-ኣካላት (ሰንጠረዥ S2) ኣብ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ስቴይኒንግ ባፈር ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን20 ደቓይቕ ምልካይ። ቅድሚ ትንተና ነቶም ዋህዮታት ኣብ ፍሎው ሳይቶሜትሪ ስቴይኒንግ ባፈር (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) ዳግማይ ምድስካል። ዳታ ቁጽሪ ዋህዮታት ንምትንታን SpectroFloን FlowJo V10ን ተጠቐም፣ ነቲ ዳታ ንምፍጣር ድማ GraphPad Prism 8 ተጠቐም። ማእከላይ ጽዓት ፍሎረሰንስ (MFI) ናይ 2-NBDGን MT DRን log-normalized ኮይኑ፡ ድሕሪኡ ንዝተመጣጠኑ ሕሙማት ንምሕሳብ ንስታቲስቲካዊ ትንተና ጽምዲ t መርመራ ተጠቒሙ። ኩሎም ትሕቲ 40 ፍጻመታት ዘለዎም ህዝቢ ካብቲ ትንተና ምእላይ፤ ቅድሚ ስታቲስቲካዊ ትንተናን ዳታ ቪዥዋላይዜሽንን ምፍጻምካ ንዝኾነ ኣሉታዊ ክብርታት 1 ዝኾነ MFI ዋጋ ኣእቱ።
ነቲ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ መስርሕ ፓነል ማንዋል ጌቲንግ ስትራተጂ ንምምላእ፡ ኣብ ፍሎውጆ ዝሞቱ ዋህዮታት ድሕሪ ምውጋድና፡ ብኣውቶማቲክ ዋህዮታት ናብቲ ህዝቢ ንምምዳብ፡ ነቲ ብቅርጺ ገደብ ገረብ (FAUST) (21) ምሉእ መግለጺ ተጠቒምናሉ። ነቲ ውጽኢት ብኢድና ነመሓድሮ፡ ነቶም ብዘይግቡእ ዝተመደቡ ዝመስሉ ህዝብታት (PD1+ ምስ PD1-tumor cells ምውህሃድ)ን ዝተዓቀቡ ህዝብታትን ንምውህሃድ። ነፍሲ ወከፍ ናሙና ብማእከላይ ገምጋም ልዕሊ 2% ዋህዮታት ዝሓዘ ኮይኑ፡ ብድምር 11 ህዝቢ እዩ።
ንፒቢኤምሲ ካብ ፍርያት ምፍላይ ሉኮሳይት ንምፍላይ ፊኮል ግራድየንት ደንሲቲ ሴንትሪፉጌሽን ተጠቒሙ (STEMCELL Technologies)። CD8 + T ዋህዮታት ካብ PBMC CD8 MicroBeads (Miltenyi) ተጠቒሞም ተነፂሎም ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ TransAct (Miltenyi) ተጠቒሞም ኣብ ምሉእ ማእኸላይ ን2 ሰሙን ተሰፊሖም። እቶም ዋህዮታት IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ኣብ ዝሓዘ ምሉእ ማእከላይ ን5 መዓልታት ደው ክብሉ ተፈቒዱሎም፣ ድሕሪኡ ብTransAct ዳግማይ ተነቓቒሖም። ኣብ መዓልቲ 7 ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ፡ ሰብኣዊ CD45 MicroBeads (Miltenyi) ኣብ ሰለስተ ተኸታተልቲ ዙርያታት ንዋህዮታት ንምህብታም ተጠቒሞም። እቶም ዋህዮታት ንፍሎው ሳይቶሜትሪ ትንተና (ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ) ተኸፋፊሎም፣ ሓደ ሚልዮን ዋህዮታት ድማ ንLC-MS/MS ትንተና ሰለስተ ግዜ ተኸፋፊሎም። እቶም ናሙናታት ከምቲ ኣብ ታሕቲ ተገሊጹ ዘሎ ብLC-MS/MS ዝተሰርሑ እዮም። እቲ ዝጎደለ ዋጋ መተቦላይት ብቑጽሪ ኣዮን 1000 ገሚትናዮ። ነፍሲ ወከፍ ናሙና ብጠቕላላ ቁጽሪ ኣዮን (TIC) ንቡር ይኸውን፣ ብሎጋሪዝም ይቕየርን ቅድሚ ትንተና ብኣውቶማቲክ ኣብ MetaboAnalystR ንቡር ይኸውን።
ናይ ነፍሲ ወከፍ ሕሙም ንጽል ዋህዮ ስንብራት ፈሲሱ ብ40 ማይክሮሜትር ፍልተር ናብ ምሉእ ማእከላይ (ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ) ተጻሪዩ። ብመሰረት ፕሮቶኮል ኣፍራዪ፡ ንዋህዮታት ሲዲ8+፣ ሲዲ4+ን ሲዲ45-ን (ኣብ በረድ) ዝተወሰዱ ናሙናታት ንምህብታም ማይክሮቢድስ (ሚልቴኒ) ተጠቒምካ ብማግኔታዊ ምፍላይ ምልክት ምልክት (Magnetic bead separation) ሰለስተ ተኸታተልቲ ዙርያታት ኣወንታዊ ምርጫ ተጠቒሞም። ብሓጺሩ እቶም ዋህዮታት ኣብ ዋህዮታት ምህብታም መከላኸሊ (ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ) ዳግማይ ተዓጽዮም ይቑጸሩ። እቶም ዋህዮታት ብናይ ሰብ CD8 ምልክት፣ ናይ ሰብ CD4 ምልክት ወይ ናይ ሰብ CD45 ምልክት (Miltenyi) ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን15 ደቓይቕ ተሓቢኦም፣ ድሕሪኡ ብዋህዮ ምህብታም መከላኸሊ ተሓፂቦም። እቲ ናሙና ብዓምዲ LS (Miltenyi) ይሓልፍ፣ እቲ ኣወንታዊን ኣሉታውን ክፋላት ድማ ይእከብ። ንውሓት ግዜ ንምንካይን ስጉምቲ ምሕዋይ ዋህዮታት ንምዕባይን፡ ድሕሪኡ እቲ CD8-ክፋል ንኻልኣይ ዙርያ ምህብታም CD4+ ይጥቀመሉ፡ እቲ CD4-ክፋል ድማ ንቐጻሊ CD45-ምህብታም ይጥቀመሉ። ኣብ ምሉእ መስርሕ ምፍላይ ነቲ ፍታሕ ኣብ በረድ ኣቐምጦ።
ንመተቦላይት ትንተና ዝኸውን ናሙናታት ንምድላው፡ እቶም ዋህዮታት ሓደ ግዜ ብበረድ ዝሑል ፍታሕ ጨው ተሓጺቦም፡ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ናሙና 1 ሚሊ ሊትር 80% ሜታኖል ተወሰኸሉ፡ ድሕሪኡ ቮርቴክስ ተገይሩሎምን ኣብ ፈሳሲ ናይትሮጅን ብስናፕ ፍሮዝን ተገይሩሎምን። እቶም ናሙናታት ንሰለስተ ዑደት ፍሪዝ-ታው ተገይሮም ብ14,000 rpm ን15 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሮም እዮም። እቲ መተቦላይት ዝሓዘ ልዕሊ ማይ ክሳብ ዝነቅጽ ይተንፈስ። እቶም መተቦላይት ኣብ 50 μl 0.03% ፎርሚክ ኣሲድ ዳግማይ ፈሲሶም፡ ንኽሕወሱ ቮርቴክስ ተገይሮም፡ ድሕሪኡ ፍርስራስ ንምእላይ ብሴንትሪፉጅ ተገይሮም እዮም።
ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ መተቦላይት ኣውጽእ ። ነቲ ልዕሊ ማይ ናብ ልዑል ብቕዓት ዘለዎ ፈሳሲ ክሮማቶግራፊ ጥርሙዝ ንመጽናዕቲ ሜታቦሎሚክስ ኣሰጋግሮ። ንነፍሲ ወከፍ ናሙና ብተመሳሳሊ ቁጽሪ ዋህዮታት ንምሕካም ንውጽኢት ዕስለ ንምክልኻል ብዘይተሓሰበ መንገዲ ዝግበር ሕክምና ፕሮቶኮል ምጥቃም። ቅድሚ ሕጂ ኣብ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ዝተሓትመ ዓለማዊ መተቦላይት ዓይነታዊ ገምጋም ኣካይድና። ክሮማቶግራፊክ ትንተናን ጫፍ ስፍሓት ውህደትን MultiQuant version 2.1 ሶፍትዌር (Applied Biosystems SCIEX) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ነቲ ዝጎደለ ዋጋ መተቦላይት ንምግማት 1000 ዝኾነ ቁጽሪ ኣዮን ተጠቒሙ፣ ካብ መስርሕ ናሙና ብመሳርሒ ትንተና ዝተኣታተወ ለውጢ ንምእራም ድማ ናይ ነፍሲ ወከፍ ናሙና TIC ንቡር ዝኾነ ጫፍ ስፍሓት ነፍሲ ወከፍ ዝተረኽበ መተቦላይት ንምሕሳብ ተጠቒሙ። TIC ንቡር ምስ ኮነ፡ MetaboAnalystR(51) (ነባሪ መለክዒ) ንሎጋሪዝማዊ ምልዋጥን ኣውቶማቲክ ኖርም መስመር ምዕባይን ይጥቀም። ኣብ መንጎ ዓይነታት ናሙና ዘሎ ፍልልይ ሜታቦሎም ዳህሳሳዊ ትንተና ንምፍጻም PCA ምስ vegan R package ተጠቒምና፣ ሕሙማት ንምትንታን ድማ ከፊላዊ ትንተና ተደራራቢ ተጠቒምና። ኣብ መንጎ ናሙናታት ዘሎ ዩክሊድያዊ ርሕቀት ንምእካብ ዴንድሮግራም ካርታ ሙቐት ንምህናጽ ሜላ ዋርድ ተጠቐም። ንሕና ሊማ (52) ኣብ ደረጃ ዝሓለወ ብዝሒ መተቦላይት ተጠቒምና ብፍልልይ ብዝሒ መተቦላይት ኣብ መላእ ዓይነት ዋህዮን ማይክሮ ከባብን ንምልላይ። ነቲ መብርሂ ንምቕላል፡ ነቲ ሞዴል ንምግላጽ ናይ ጉጅለ ማእከላይ መለክዒ ንጥቀም፡ ከምኡ’ውን ኣብ ማይክሮ ከባቢ ዝርከቡ ዓይነታት ዋህዮታት ከም ነፍሲ ወከፍ ጉጅለ (n = 6 ጉጅለታት) ንቖጽሮም፤ ንፈተነ ትርጉም፡ ንነፍሲ ​​ወከፍ መተቦላይት ሰለስተ ተደጋጋሚ መለክዒታት ኣካይድና ናይ ሓሶት ምብዛሕ ንኸይፍጠር፡ እቲ ሕሙም ኣብ ዲዛይን ሊማ ከም ዕንቅፋት ተኻቲቱ። ኣብ መንጎ ዝተፈላለዩ ሕሙማት ዘሎ ፍልልይ መተቦላይት ንምፍታሽ፡ ንሕሙማት ሓዊሱ ነቲ ሞዴል ሊማ ብውሱን መንገዲ ኣስተኻኺልናዮ። ንሕና ትርጉም ናይቲ ኣቐዲሙ ዝተወሰነ ንጽጽር ኣብ መንጎ ዓይነት ዋህዮን ማይክሮ ከባብን Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction) ንሕብር።
ድሕሪ ምህብታም ብርታዐ Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) ብምጥቃም፡ ንጽል-ዋህዮ ትራንስክሪፕቶም መስርዕ ኣብ ጠቕላላ ህያው ፍሮዝን ኣሲትስን ናሙናታት ሕበጥን 10x 5′ጂን መግለጺ ፕሮቶኮል ተጠቒምካ ተኻይዱ። ዋላ እኳ ካብ ሓደ ናሙና ሕበጥ ዝረኸቦ ትሑት ህይወት ንኸይካተት እንተኸልከለ፡ ሓሙሽተ ዝመሳሰሉ ሕበጥን ኣሲትስን ዘለዎም ሕሙማት ተተንቲኖም። ብዙሕ ምርጫታት ሕሙማት ንምዕዋት፡ ናሙናታት ነፍሲ ወከፍ ሕሙም ኣብ መስመራት ናይቲ 10x ክሮሚየም ተቖጻጻሪ ኣወሃሂድና፡ ነቲ ኣሲትስን ናይ ሕበጥን ቦታታት ብተናጸል ተንቲንናዮ። ድሕሪ መስርዕ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ጽምዲ መወዳእታ (PE)፣ ጂኖም ኩቤክ፤ ብማእከላይ ገምጋም 73,488ን 41,378ን ንባባት ኣብ ሓደ ዋህዮ ንሕበጥን ንኣሲትስን ብቕደም ተኸተል]]፣ CellSNPን Vireoን (53)ን ተጠቒምና (ኣብ CellSNP ከም The common human SNP (VCF) provided by GRCh38 is assigned a donor identity. We use SNPRelate to infer the closest identity (IBS) of the patient's genotype status (IBS), excluding unassigned cells and cells identified as duplexes and matching donors between ascites and tumor samples (54) ኣብ መሰረት እዚ ዕማም ኣብቲ ሕበጥን ኣሲትስን ብብዝሒ ዋህዮታት ውክልና ዘለዎም ሰለስተ ጉዳያት ንታሕቲ ትንተና ድሕሪ ምፍጻም ኣብ ፋሕፋሕ (55)ን ስክራን (56) ባዮኮንዳክተር መዐሸጊን ስጉምቲ ጅምላዊ ምፍታሕ ዓቂብና። (2792ን 4183ን ዋህዮታት ካብ ሕበጥን ascites, ብቕደም ተኸተል) ንትንተና ንሕና igraph's (57) Louvain ምትእኽኻብ ኣብ Jaccard ርሕቀት ናብ ክላስተር ዋህዮታት ብመግለጺ መሰረት ንጥቀም ብመግለጺ CD8Aን GZMAን ዝተገልጸ፣ ትሑት ራይቦሶማዊ ፕሮቲን መግለጺ ዘለዎም ንኡሳን ጕጅለታት ከይሓወሰ፣ ንሕና ነቲ ዝተሓትመ ዳታ ናይ Izar et al (16) ረኺብናዮ፣ ንሱ ድማ t-SNE ምትእትታዎም ሓዊሱ፣ ኣብ መንጎ ናይ ምክልኻል ዋህዮ ምልክታትን NNMT መግለጺን ዘሎ መግለጺ ምድብላቕ ክቆጻጸር ይኽእል።
ፒቢኤምሲ ካብ ፍርያት ምፍላይ ሉኮሳይት (STEMCELL Technologies) ብፊኮል ግራድየንት ደንሲቲ ሴንትሪፉጌሽን ተፈልዮም እዮም። CD3 + ዋህዮታት ካብ PBMC CD3 beads (Miltenyi) ተጠቒሞም ተነጺሎም። ኣብ ህላወ ወይ ዘይምህላው MNA፡ ዋህዮታት CD3+ ብፕሌት ዝተኣሳሰሩ CD3 (5μg/ml)፡ ዝፈስስ CD28 (3μg/ml)ን IL-2ን (300 U/ml; Proleukin) ተነቒሎም። ኣብታ ናይ መወዳእታ መዓልቲ ምስፍሕፋሕ፡ ተግባራዊነት (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience)ን ምብዛሕን (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ብፍሎው ሳይቶሜትሪ ተገምጊሙ። ን4 ሰዓታት ብፒኤምኤ (20 ng/ml)ን ionomycin (1μg/ml)ን ብGolgiStop ንዋህዮታት ብምንቕቓሕ ናይ effector ተግባር ምግምጋም፣ ከምኡ’ውን CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ከምኡ’ውን TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) ምክትታል። ንዋህዮታት qPCRን ChIPን ብ PMA (20 ng/ml)ን ionomycin (1μg/ml)ን ን4 ሰዓታት ምልዕዓል። እቲ ELISA supernatant ቅድሚን ድሕሪን ምልዕዓል ብPMA (20 ng/ml)ን ionomycin (1 μg/ml)ን ን4 ሰዓታት ተኣኪቡ።
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ተጠቒምካ RNA ንምንጻል ናይቲ ኣፍራዪ ፕሮቶኮል ተኸተል። ነቲ ናሙና ሓደ ዓይነት ንምግባር QIAshredder (QIAGEN) ተጠቐም። ንመመላእታ ዲኤንኤ (cDNA) ንምስራሕ ልዑል ዓቕሚ ዘለዎ RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) ምጥቃም። ንመግለጺ ጂን (ብመሰረት ፕሮቶኮል ኣፍራዪ) ብቑጽሪ ንምግማት TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ምጥቃም በዞም ዝስዕቡ መርመራታት: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ግሊሰራልደሃይድ-3-ፎስፌት ኦፍ ሃይድሮጅን (GAPDH)] ከምኡ’ውን Hs01010726_m1 (SLC22A2)። እቶም ናሙናታት ኣብ StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ኣብ MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) ምስ MicroAmp optical film ዝተኻየዱ እዮም። ዝኾነ ካብ 35 ንላዕሊ ዝኾነ ዋጋ Ct ልዕሊ ደረት ምልላይ ከም ዝኾነ ይቑጸር እሞ ከም ዘይፍለጥ ይምልከት።
ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ቺፕ ምፍጻም (58)። ብሓፂሩ እቶም ዋህዮታት ብፎርማልደሃይድ (ናይ መወዳእታ ትሕዝቶ 1.42%) ተሓኪሞም ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን10 ደቓይቕ ተሓቢኦም እዮም። ን10 ደቓይቕ ኣብ በረድ ዝተመላእ ናይ ሕበጥ መከላኸሊ (25 ሚሊ ሜተር Hepes, 1.5 ሚሊ ሜትር MgCl2, 10 ሚሊ ሜትር KClን 0.1% NP-40ን) ምጥቃም፣ ድሕሪኡ ከምቲ ዝተገልጸ ኣብ ኢሙኖፕረሲፒቴሽን መከላኸሊ ዳግማይ ምዕጻው (58)። ብድሕሪኡ እቲ ናሙና በዞም ዝስዕቡ ዑደታት sonicated ተገይሩ: 10 ዑደታት (20 1-ካልኢት ናህሪ)ን 40 ካልኢት ስታትቲክ ግዜን። ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) and SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) ጸረ-ኣካላት ምስቲ ናሙና ኣብ 4°CC ምውጥዋጥ ንሓደ ለይቲ ምሕቃቕ። ፕሮቲን ኤ ቢድስ (Thermo Fisher Scientific) ምስቲ ናሙና ኣብ 4°C ብለዋህ ምንቅጥቃጥ ን1 ሰዓት ምሕቃቕ፣ ድሕሪኡ ቸሌክስ ቢድስ (Bio-Rad) ተጠቒምካ ነቲ ዲኤንኤ ምህብታም፣ ንፕሮቲን ምሕቃቕ ድማ ፕሮቲነዝ ኬ (Thermo Fisher) ምጥቃም። TNFα ፕሮሞተር ብPCR ተረኺቡ: ንቕድሚት፣ GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT፤ ብኣንጻሩ GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ፍርያት)። እቶም ምስልታት ብኢሜጅ ላብ (ባዮ-ራድ) ዝተሰርሑ ኮይኖም ብኢሜጅጀይ ሶፍትዌር ተጠቒሞም ብዝሒ ዝተወሰኑ እዮም።
እቲ ናይ ዋህዮ ባህሊ ልዕሊ ማይ ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ ተኣኪቡ። እቲ ውሳነ ብመሰረት ኣገባባት ኣፍራዪ ሰብኣዊ TNFα ELISA ኪት (Invitrogen)፣ ሰብኣዊ IL-2 ELISA ኪት (Invitrogen)ን ሰብኣዊ IFN-γ ELISA ኪት (Abcam)ን እዩ ተኻይዱ። ብመሰረት ፕሮቶኮል ኣፍራዪ፡ እቲ ልዕሊ ማይ ብ1:100 ተቐላቒሉ TNFαን IL-2ን ንምፍላጥ፡ IFN-γን ንምፍላጥ ድማ 1:3 ተቐልቂሉ። ኣብ 450 ና.ሜ ምምጥጣን ንምዕቃን EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ተጠቐም።
ፒቢኤምሲ ካብ ፍርያት ምፍላይ ሉኮሳይት (STEMCELL Technologies) ብፊኮል ግራድየንት ደንሲቲ ሴንትሪፉጌሽን ተፈልዮም እዮም። CD3 + ዋህዮታት ካብ PBMC CD3 beads (Miltenyi) ተጠቒሞም ተነጺሎም። ኣብ ህላወ ወይ ዘይምህላው MNA፡ ዋህዮታት CD3+ ብፕሌት-bound CD3 (5μg/ml)፡ ዝፈስስ CD28 (3μg/ml) ከምኡ’ውን IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ን3 መዓልታት ተነቒሎም። ድሕሪ 3 መዓልቲ እቶም ዋህዮታት ተኣኪቦም ብ0.9% ጨው ተሓፂቦም፣ እቲ ሽጉርቲ ድማ ስናፕ ፍሮዝን ተገይሩ። ቁጽሪ ዋህዮታት ብፍሎው ሳይቶሜትሪ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) 123count eBeads ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ መተቦላይት ኣውጽእ ። እቲ ዝነቐጸ ቅብኣት ብ4000 ዋህዮ መመዘኒታት/μl ዳግማይ ተዋዲዱ። ነቲ ናሙና ብተገላባጢ-ምዕራፍ ክሮማቶግራፊ (1290 ኢንፊኒቲ II, ኣጂለንት ቴክኖሎጂስ, ሳንታ ክላራ, ሲኤ) ከምኡ’ውን CORTECS T3 ዓምዲ (2.1×150 ሚ.ሜ, ስፍሓት ንጥረ ነገር 1.6-μm, ስፍሓት ፖር 120-Å; #186008500, ዋተርስ) ትንተና። ፖላር ማስ ስፔክትሮሜተር (6470, Agilent)፣ ኣብኡ ኤሌክትሮስፕራይ ኣዮናይዜሽን ብኣወንታዊ ሞድ ይሰርሕ። ተንቀሳቓሲ ምዕራፍ A 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ (ኣብ H2O)፣ ተንቀሳቓሲ ምዕራፍ B 90% ኣሲቶኒትራይል፣ 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ እዩ። LC gradient ን100% A ካብ 0 ክሳብ 2 ደቓይቕ፣ ን99% B ካብ 2 ክሳብ 7.1 ደቓይቕ፣ ን99% B ድማ ካብ 7.1 ክሳብ 8 ደቓይቕ ይኸውን።ድሕሪኡ ነቲ ዓምዲ ምስ ተንቀሳቓሲ ምዕራፍ A ብፍሰት 0.6 ሚሊ ሊትር/ደቒቕ ን3 ደቓይቕ ዳግማይ ሚዛን ግበሮ። . ፍጥነት ዋሕዚ 0.4ml/min ኮይኑ፡ እቲ ዓምዲ ክፍሊ ድማ ክሳብ 50°C ይውዕይ። ናይ MNA ጽሩይ ኬሚካላዊ ደረጃ (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ተጠቒምካ ናይ ምዕቃብ ግዜ (RT)ን ትራንስፎርሜሽንን (RT = 0.882 ደቓይቕ፣ ትራንስፎርሜሽን 1 = 137→94.1፣ ትራንስፎርሜሽን 2 = 137→92 ፣ ምቕያር 3 = 137→78) ምምስራት። ሰለስቲኦም ምስግጋራት ኣብ ቅኑዕ ናይ ምዕቃብ ግዜ ምስ ዝፍጸሙ፡ ምስግጋር 1 ንብዝሒ ንምርግጋጽ ፍሉይነት ይጥቀመሉ። ስታንዳርድ ካርቭ ናይ MNA (Toronto Research Chemical Company) ብሽዱሽተ ተኸታታሊ ምፍሳስ ናይቲ ስቶክ ሶሉሽን (1 mg/ml) ተፈጢሩ 0.1፣ 1.0፣ 10ን 100ን ng/mlን 1.0ን 10μg/mlን ፈሳሲ ስታንዳርድ ረኺቡ። እቲ ናይ ምልላይ ደረት 1 ng/ml ኮይኑ፡ እቲ መስመራዊ ምላሽ ድማ ካብ 10 ng/ml ክሳብ 10μg/ml እዩ። ነፍሲ ወከፍ መርፍእ ክልተ ማይክሮሊተር ናሙናን ስታንዳርድን ንLC/MS ትንተና ዝውዕል ኮይኑ፡ ምርግጋእ ናይቲ ትንተና መድረኽ ንምርግጋጽ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ሸሞንተ መርፍእ ዝተሓዋወሰ ናሙና ቁጽጽር ጽሬት ይካየድ። ናይ ኩሎም ብMNA ዝተሓከሙ ናሙናታት ዋህዮታት MNA መልሲ ኣብ ውሽጢ መስመራዊ ደረጃ ናይቲ መርመራ እዩ ​​ነይሩ። ትንተና መረዳእታ ብ MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ካልኣይ ወለዶ αFR-CAR ኮንስትራክት ካብ Song et al. (59)። ብሓጺሩ እቲ ህንጻ እዞም ዝስዕቡ ትሕዝቶታት ዝሓዘ እዩ፡ CD8a መራሒ መስርዕ፡ ሰብኣዊ αFR-ፍሉይ ንጽል-ሰንሰለት ተለዋዋጢ ቁራጽ፡ CD8a ሂንጅን ትራንስሜምብሬን ዞባን፡ CD27 ውሽጣዊ ዋህዮ ዓውዲን CD3z ውሽጣዊ ዋህዮ ዓውዲን። እቲ ምሉእ CAR መስርዕ ብ GenScript ተሰሪሑ፣ ድሕሪኡ ናብቲ ንብቕዓት ምትሕልላፍ ንምግምጋም ዝተጠቕመሉ GFP መግለጺ ካሴት ኣብ ላዕሊ ዘሎ ካልኣይ ወለዶ lentiviral expression vector ክሎን ተገይሩ።
ሌንቲቫይረስ ብትራንስፌክሽን ዋህዮታት HEK293T እዩ ዝፍጠር [ኣሜሪካን ታይፕ ካልቸር ኮሌክሽን (ATCC); ኣብ 10% ጽግያት ሴረም ከብቲ (FBS)ን 1% PenStrepን ዝሓዘ ናይ ዱልቤኮ ዝተመሓየሸ ንስሪ ማእከላይ ዝዓበየ ኮይኑ፡ CAR-GFP vectorን ተጠቒሙን The packaging plasmids (psPAX2 and pMD2.G, Addgene) lipofection amine (Sigma-Aldrich) ይጥቀሙ። እቲ ቫይረስ ዝሓዘ ልዕሊ ማይ ድሕሪ 48ን 72ን ሰዓታት ትራንስፌክሽን ተኣኪቡ ተጣሒኑ ብኣልትራሴንትሪፉጌሽን ተጠርኒፉ። ነቲ ዝተዋህለለ ቫይራል ሱፐርናታንት ክሳብ ትራንስዳክሽን ኣብ -80 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ኣቐምጦ።
ፒቢኤምሲ ካብ ጥዑያት ለጋሲ ፍርያት ምፍላይ ሉኮሳይት (STEMCELL Technologies) ብፊኮል ግራድየንት ደንሲቲ ሴንትሪፉጌሽን ይፍለዩ። ካብ PBMC ዋህዮታት CD8+ ንምንጻል ኣወንታዊ ምርጫ CD8 ማይክሮቢድስ (Miltenyi) ምጥቃም። ንዋህዮታት ቲ ብትራንስኣክት (ሚልተኒ) ከምኡ’ውን ኣብ ቴክስማክስ ማእከላይ [ሚልተንዪ፤ ብ3% ብሙቐት ዘይተንቀሳቐሰ ሰብኣዊ ሴረም፣ 1% ፐንስትረፕን IL-2ን (300 U/ml)] ዝተመላእ እዩ። ድሕሪ ዕስራን ኣርባዕተን ሰዓታት ምልዕዓል፡ ዋህዮታት ቲ ብሌንቲቫይረስ (10 μl concentrated virus supernatant per 106 cells) ተቐይሮም እዮም። ድሕሪ 1 ክሳብ 3 መዓልታት ድሕሪ ምትሕልላፍ ኣብ Cytek Aurora (ኣብ FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ብውሑዱ 30% ናይ ምትሕልላፍ ብቕዓት ንምርኣይ ናይ GFP መግለጺ ናይቶም ዋህዮታት ምግምጋም።
ዋህዮታት CAR-T ኣብ ትሕቲ እዞም ዝስዕቡ ኩነታት ኣብ Immunocult (STEMCELL Technologies; ብ1% PenStrep ዝተመላእኩ) ን24 ሰዓታት ተዓብሊሎም: ዘይተሓከሙ: ብ250 μM adenosine ወይ 10 mM MNA ዝተሓከሙ። ድሕሪ ቅድመ-ሕክምና፡ ዋህዮታት CAR-T ብPBS ተሓጺቦም ምስ 20,000 ዋህዮታት SK-OV-3 [ATCC; ኣብ McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) ብ10% FBSን 1% PenStrepን ኣብ 10 ዝተመላእ: እቲ effector to target ratio 1 ኣብ ዝተመላእ Immunocult medium ብሰለስተ ዕጽፊ ተዓብሊሉ። SK-OV-3 ዋህዮታትን SK-OV-3 ዋህዮታትን ብዲጂታሊስ ሳፖኒን (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) lysed ከም ኣሉታዊን ኣወንታዊን ቁጽጽር ብቕደም ተኸተል ተጠቒሞም። ድሕሪ 24 ሰዓታት ብሓባር ምልማዕ እቲ ልዕሊ ማይ ተኣኪቡ እቲ ላክቴት ዲሃይድሮጂነዝ (LDH) ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) ተለኪዑ። እቲ LDH supernatant ኣብ LDH buffer 1:50 ተቐላቒሉ። ሚእታዊት ቅትለት በዚ ዝስዕብ ቀመር ተጠቒምካ እዩ ተለኪዑ፡ ሚእታዊት ቅትለት = ሚእታዊት ምእራም / ዝለዓለ መጠን ቅትለት x 100%፡ ኣብዚ ሚእታዊት ምእራም = ሓባራዊ ባህሊ-T ዋህዮታት ጥራይ፡ ከምኡ’ውን ዝለዓለ መጠን ቅትለት = ኣወንታዊ ቁጽጽር-ኣሉታዊ ቁጽጽር።
ከምቲ ኣብቲ ጽሑፍ ወይ ንዋትን ኣገባባትን ዝተገልጸ ንስታቲስቲካዊ ትንተና GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ወይ R v3.6.0 ተጠቐም። ካብ ሓደ ሕሙም ብዙሓት ናሙናታት እንተተኣኪቦም (ከም ኣሲትስን ሕበጥን)፡ ጽምዲ t መርመራ ንጥቀም ወይ ድማ ከም ኣድላይነቱ ነቲ ሕሙም ከም ዕድመ ንእስነት ኣብ መስመራዊ ወይ ሓፈሻዊ ሞዴል ነካትቶ። ንትንተና ሜታቦሎሚክስ፡ እቲ ናይ ኣገዳስነት ፈተና ብሰለስተ ቅዳሕ ይፍጸም።
ነዚ ጽሑፍ ዝኸውን ተወሳኺ ጽሑፋት ንምርካብ፡ በጃኹም http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ተወከሱ
እዚ ብመሰረት ውዕል ክሪኤቲቭ ኮመንስ ኣትሪብዩሽን-ዘይንግዳዊ ፍቓድ ዝተዘርግሐ ክፉት ተበጻሕነት ዘለዎ ጽሑፍ ኮይኑ፡ ኣብ ዝኾነ ማዕከን ዜና ምጥቃም፡ ምዝርጋሕን ምብዛሕን ዘፍቅድ ኮይኑ፡ እቲ ናይ መወዳእታ ኣጠቓቕማ ንንግዳዊ መኽሰብ ክሳብ ዘይኮነን እቲ መበገሲ ስራሕ ቅኑዕ ምዃኑን ክሳብ ዝኾነን እዩ። መጣቀሲ።
መተሓሳሰቢ፡ እቲ ናብቲ ገጽ ዝመኽርካዮ ሰብ ነቲ ኢመይል ክርእዮ ከም እትደልዮን ስፓም ከም ዘይኮነን ምእንቲ ክፈልጥ ጥራይ ኢና ኢመይልካ ክትህብ ንሓትት። ዝኾነ ናይ ኢመይል ኣድራሻ ኣይንሕዝን ኢና።
እዚ ሕቶ እዚ በጻሒ ምዃንካ ንምፍታንን ኣውቶማቲክ ስፓም ምቕራብ ንምክልኻልን ዝውዕል እዩ።
ማሪሳ ኬ ኪልጎር (ማሪሳ ኬ ኪልጎር)፡ ሳራ ማክፈርሰን (ሳራ ማክፈርሰን)፡ ሎረን ጂ ዘካርያስ (ሎረን ጂ ዘካርያስ)፡ ኣቢጋይል ኤሊ ኣሪስ ጂ ዋትሰን (ኤች ዋትሰን)፡ ጆን ስታግ (ጆን ስታግ)፡ ብራድ ኤች ኔልሰን (ብራድ ኤች ኔልሰን)፡ ራልፍ ጀይ ደ ቤላርዲኒ (ራልፍ ጀይ ደቤራዲኒስ)፡ ራስል ጂ ጆንስ (ሩሰል ጂ ጆንስ)፡ ፊኒያስ ቲ ሃሚልተን (ፊንያስ ቲ.
MNA ኣብ ምዕፋን ሕማም ምክልኻል ዋህዮታት ቲ ኣበርክቶ ዝገብር ኮይኑ፡ ንሕክምና መንሽሮ ደቂ ሰባት ክኸውን ዝኽእል ዕላማ ኢሚዩኖቴራፒ ይውክል።
ማሪሳ ኬ ኪልጎር (ማሪሳ ኬ ኪልጎር)፡ ሳራ ማክፈርሰን (ሳራ ማክፈርሰን)፡ ሎረን ጂ ዘካርያስ (ሎረን ጂ ዘካርያስ)፡ ኣቢጋይል ኤሊ ኣሪስ ጂ ዋትሰን (ኤች ዋትሰን)፡ ጆን ስታግ (ጆን ስታግ)፡ ብራድ ኤች ኔልሰን (ብራድ ኤች ኔልሰን)፡ ራልፍ ጀይ ደ ቤላርዲኒ (ራልፍ ጀይ ደቤራዲኒስ)፡ ራስል ጂ ጆንስ (ሩሰል ጂ ጆንስ)፡ ፊኒያስ ቲ ሃሚልተን (ፊንያስ ቲ.
MNA ኣብ ምዕፋን ሕማም ምክልኻል ዋህዮታት ቲ ኣበርክቶ ዝገብር ኮይኑ፡ ንሕክምና መንሽሮ ደቂ ሰባት ክኸውን ዝኽእል ዕላማ ኢሚዩኖቴራፒ ይውክል።
©2021 ማሕበር ምዕባለ ሳይንስ ኣሜሪካ። ኩሉ መሰላት ዝተሓለወ እዩ። AAAS መሻርኽቲ ናይ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ከምኡ ውን COUNTER እዩ። ሳይንስኣድቫንስ ISSN 2375-2548።