ኣብ መንገዲ ምፍሳስ ፕሮቲን ምፍላይ ዋህዮታት ምክፍፋልን ሆሞስታሲስን ንምዕቃብ ኣገዳሲ እዩ። ብዘይካ እቲ ብሸል ዝመሓላለፍ ምፍላይ፡ ተራ ሽኮር ኣብ ምፍላይ ኪነሲን ኣብ መስርሕ ምጉዕዓዝ ምፍሳስ ንነዊሕ እዋን ዝጸንሐ መሰረታዊ ሕቶ ኮይኑ፡ ገና ዘይተመለሰ እዩ። ኣብዚ፡ ንሕና 3D ብሓንሳብ ብዙሕ ሕብሪ ልዑል ርዝነት ሓቀኛ ግዜ ምስሊ ንፍጽም ኣብ vivo ሓደስቲ ዝተሰርሑ glycosylphosphatidylinositol-immobilized ፕሮቲናት ምስ ኣዝዩ ነዊሕ ceramide lipid moieties ተጠርኒፎምን ኣብ ፍሉያት endoplasms ጽሩይ መውጽኢ ቦታ ይምደቡ, እዚ ድማ ካብቲ ብtransmembrane ፕሮቲናት ዝጥቀሙሉ ዝተፈልየ ምዃኑ ንምርግጋጽ። ብተወሳኺ፡ ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ ኣብ ሽፋን ኢንዶፕላዝማዊ ረቲኩሉም ነዚ ምፍላይ ምምራጽ ወሳኒ ምዃኑ ነርኢ። መጽናዕትና ኣብ ንውሓት ሰንሰለት ሽኮር ዝተመርኮሰ ጽዕነት ፕሮቲን ናብ ምሩጽ ናይ ሰደድ ቦታታት ኣብ መንገዲ ምፍሳስ ንምምዳብ ናይ መጀመርታ ቀጥታዊ ኣብ ውሽጢ ሰብነት መርትዖ ይህብ።
ኣብ ዩካርዮቲክ ዋህዮታት፡ እቶም ኣብ ኢንዶፕላዝሚክ ረቲኩሉም (ER) ዝተሰርሑ ፕሮቲናት ድሕሪኡ ኣብ እዋን መጓዓዝያ ብመንገዲ እቲ ምፍሳስ ደም ተፈላልዮም ናብቲ ዝምጥን ዋህዮኣዊ መዕለቢኦም ይበጽሑ (1)። ብዘይካ’ቲ ብካቦት ዝመሓላለፍ ምፍላይ፡ ገለ ሽኮራት’ውን ኣብ ፍሉያት ሽፋን ዶመይናት ንፍሉያት ፕሮቲናት (2-5) ብምእካብ ከም ምሩጽ መውጽኢ ነጥብታት ከገልግሉ ከም ዝኽእሉ ንነዊሕ እዋን ይግመት ነይሩ። ይኹን እምበር፡ ነዚ ክኸውን ዝኽእል ኣብ ሽኮር ዝተመርኮሰ ኣገባብ ዘረጋግጽ ቀጥታዊ ኣብ ውሽጢ ሰብነት (in vivo) መርትዖታት ገና የለን። ነዚ መሰረታዊ ጸገም ንምፍታሕ፡ ኣብ ማይ ብሑቝ፡ ግላይኮሲልፎስፋቲዲሊኖሲቶል (GPI) መልሕቕ ዘለዎም ፕሮቲናት (GPI-APs) ካብ ER ብኸመይ ብፍልልይ ከም ዝለኣኹ ኣጽኒዕና። GPI-APs ዝተፈላለዩ ምስ ሽኮር ዝተኣሳሰሩ ናይ ዋህዮ ገጽ ፕሮቲናት እዮም ( ​​6, 7)። GPI-AP ብመንገዲ ግላይኮሊፒድ ክፋል (GPI anchor) ኣብ ደጋዊ ቆጽሊ ሽፋን ፕላዝማ ዝተተሓሓዘ ዝፍኖ ፕሮቲን እዩ። ንሳቶም GPI መልህቕ ከም ዓቃባዊ ድሕረ-ትርጉማዊ ምምሕያሻት ኣብ ER lumen (8) ይቕበልዎም። ድሕሪ ምትእስሳር GPI-AP ብመንገዲ Golgi apparatus (5, 9) ካብ ER ናብ ፕላዝማ ሽፋን ይሓልፍ። ህላወ GPI መልህቕ GPI-AP ካብ ትራንስሜምብሬን ዝፍንዉ ፕሮቲናት (ካልኦት ፕላዝማ ሽፋን ፕሮቲናት ሓዊሱ) ብፍሉይ ብመንገዲ ምፍሳስ ክጓዓዝ ይገብሮ (5, 9, 10)። ኣብ ዋህዮታት ማይ ብሑቝ፡ GPI-APs ካብ ካልኦት ኣብ ኢንዶፕላዝሚክ ረቲኩለም ዝፍሰሱ ፕሮቲናት ይፍለዩ፡ ድሕሪኡ ድማ ብኮት ፕሮቲን ኮምፕለክስ II (COPII) ዝተጠቕለሉ ፍሉያት ቬሲኩላት ይዕሸጉ (6, 7)። ወሰንቲ ናይዚ መስርሕ ምደባ ኣብ መስርሕ ሰደድ ER ንጹር ኣይኮነን፡ እንተኾነ ግን እዚ ኣገባብ ሽኮር ከድልዮ ከም ዝኽእል ይግመት፡ ብፍላይ ድማ መዋቕራዊ ዳግመ-ምህናጽ ናይቲ ሽኮር ክፋል ናይቲ GPI መልህቕ (5, 8)። ኣብ ማይ-በሰላ፡ ዳግመ-ምህናጽ ሽኮር ጂፒኣይ፡ ጂፒኣይ ምስ ተተሓሓዘ ብቕጽበት ይጅምር፡ ኣብ ብዙሕ ኣጋጣሚታት ድማ፡ ሴራማይድ ምስቲ 26 ካርቦን ዘለዎ ነዊሕ ሰንሰለት ዘለዎ ጽጉብ ስብሒ ኣሲድ (C26:0) ክተሓሓዝ ይገብር (11, 12)። C26 ceramide ክሳብ ሕጂ ብዋህዮታት ማይ ብሑቝ ዝፍጠር ቀንዲ ሴራማይድ እዩ። ኣብ ER ዝስራሕ ኮይኑ መብዛሕትኡ ድማ ብመንገዲ COPII vesicles ናብ Golgi apparatus ይለኣኽ (13)። ER ሰደድ GPI-AP ብፍላይ ቀጻሊ ምትእኽኻብ ሴራማይድ (14, 15) የድልዮ፣ ብግዲኡ ድማ፣ ምቕያር ሴራማይድ ናብ ኢኖሲቶል ፎስፌት ሴራማይድ (IPC) ኣብ ኣፓራቱስ ጎልጂ ኣብ ምትእኽኻብ መልህቕ GPI ይምርኮስ (16)። ብኣርቲፊሻል ሽፋናት ዝተገብረ ባዮፊዚካዊ መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ፡ ኣዝዮም ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎም ሴራማይድስ ተዋሃሂዶም ፍሉይ ፊዚካዊ ባህርያት ዘለዎም ስርዓት ዘለዎም ዶመይናት ክፈጥሩ ይኽእሉ (17, 18)። እዞም መረዳእታታት እዚኦም፡ C26 ሴራማይድን GPI-AP ምስ C26 ሴራማይድን ኣካላዊ ባህርያቶም ተጠቒሞም ኣብቲ ብተዛማዲ ዕግርግር ዝመልኦ ER ሽፋን ሽኮር ከባቢ ናብ ስርዓት ዘለዎም ዞባታት ወይ ዞባታት ይወሃሃዱ ዝብል ግምታዊ መርትዖ ይመርሕ። ብቐንዱ ብሓጸርቲን ዘይተጸገቡን ግሊሰሮሊፒድስ (C16:1ን C18:1ን) ዝቖመ እዩ (19, 20)። እዞም ዞባታት ብመምረጺ ኣብ ፍሉያት ናይ ER መውጽኢ ቦታታት (ERES) ዘተኮሩ ክኾኑ እዮም፣ ኣብዚ ሴራማይድን ሴራማይድ መሰረት ዝገበረ GPI-APን ብሓባር ናብ ጎልጂ ኣብ ሓደ ውፉይ COPII ቬሲክል (5) ክመሓላለፍ ይኽእል።
ኣብዚ መጽናዕቲ፡ ነዚ ኣብ ስብሒ ዝተመርኮሰ ኣገባብ ብቐጥታ ፈቲንናዮ ኣለና፡ ሱፐር-ሪዞሉሽን ኮንፎካል ሪል-ታይም ኢሜጅንግ ማይክሮስኮፒ (SCLIM) ብምጥቃም፡ እዚ ድማ ብሓንሳብ ብፍሎረሰንት ዝተለጠፉ ፕሮቲናት ክዕዘብ ዝኽእል ምዕቡል ማይክሮስኮፒ ሜላ እዩ እቶም ሰለስተ ሕብርን ሰለስተ-መኣዝናዊን (3D) ምስልታት ኣብ ህያዋን ዋህዮታት ኣዝዩ ልዑል ርዝነትን ፍጥነትን ኣለዎም (21, 22)።
መጀመርያ SCLIM ቴክኖሎጂ ተግባራዊ ብምግባር ንቡር GPI-AP ምስ C26 ceramide group ከመይ ጌሩ ካብ ትራንስሜምብሬን ዝፍኖ ፕሮቲናት ድሕሪ ምውጻእ ካብ ER ኣብ S. cerevisiae ከምዝተመርመረ ንምግላጽ እዩ። ምደባ ER ንምፍታሽ፡ ኣብ vivo (7, 23) ናብ ERES ዝኣቱ ሓደስቲ ዝተሰርሑ ጽዕነት ብቐጥታ ክስእል ዝኽእል ጀነቲካዊ ስርዓት ተጠቒምና። ከም ጽዕነት፡ ብቀጠልያ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (GFP) ዝተለጠፈ C26 ሴራማይድ መሰረት ዝገበረ GPI-AP Gas1ን ብናይ ቀረባ ትሕተ ቀይሕ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (iRFP) ዝተለጠፈ ትራንስሜምብሬን ዝፍኖ ፕሮቲን Mid2ን መሪጽና፣ ክልቲኦም ንሽፋን ፕላዝማ ዝዓለሙ እዮም (24-26)። ኣብቲ sec31-1 ሙቐት-ተሃዋሲ ምውታን እዞም ክልተ ጽዕነት ኣብ ትሕቲ ጋላክቶስ-inducible ፕሮሞተርን constitutive ERES markerን ይግለጹ። ኣብ ጽንኩር ሙቐት (37°C)፡ እቲ sec31-1 ምትዕርራይ ንስራሕ ናይ COPII ካቦት ባእታ Sec31 ስለ ዝጸልዎ፡ ንCOPII ምብቋልን ER ሰደድን ንምዕጋት፡ ሓደስቲ ዝተሰርሑ ጽዕነት ኣብ ER ይእከብ (23)። ድሕሪ ምዝሓል ናብ ትሑት ሙቐት (24 ዲግሪ ሰንቲግሬድ)፡ እቶም sec31-1 ዝለዋወጡ ዋህዮታት ካብቲ ምፍሳስ ቦታ ተመሊሶም፡ እቲ ዝተዋህለለ ሓድሽ ስነ-ጥበባዊ ጽዕነት ድማ ካብ ER ናብ ወጻኢ ክለኣኽ ጀሚሩ። CLIM visualization መብዛሕትኦም ሓደስቲ ዝተሰርሑ Gas1-GFPን Mid2-iRFPን ጌና ኣብ ER ናይ sec31-1 ምልዋጥ ዋህዮታት ድሕሪ ምሕቃቕ ኣብ 37°C ከምዝተዋህለሉን ድሕሪኡ ኣብ 24°C ን5 ደቓይቕ ከምዝተለቐቑን ኣርእዩ (ስእሊ 1)። Mid2-iRFP ኣብ ምሉእ ER ሽፋን ስለዝተዘርግሐ፡ Gas1-GFP ድማ ኣብቲ ዘይቀጻሊ ER ሽፋን ከባቢ ስለዝተዋህለለን ስለዝተኣከበን፡ ዝርገሐኦም ፍጹም ዝተፈላለየ እዩ (ስእሊ 1፡ A ክሳብ Cን ፊልም S1ን)። ብተወሳኺ ከምቲ ኣብ ስእሊ 1D ንርእዮ ዘለና Gas1-GFP ክላስተር Mid2-iRFP የብሉን። እዞም ውጽኢታት ከምዘመልክትዎ፡ GPI-APን ትራንስሜምብሬን ፕሮቲናትን ብኣግኡ ናብ ዝተፈላለዩ ዞባታት ሽፋን ER ከምዝተፈላለዩ ይሕብሩ። እቲ Gas1-GFP ክላስተር ምስ ፍሉይ ERES ብmCherry's COPII ካቦት ፕሮቲን Sec13 (ስእሊ 1, E and F, ከምኡ'ውን ፊልም S1) (23) ዝተለጠፈ ይቐርብ።
sec31-1 ዋህዮታት ጋላክቶስ-ዝተደረኸ ምፍሳስ ይገልጹ፣ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት (C26) ሴራማይድ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ቀጠልያ)ን ትራንስሜምብሬን ፕሮቲን Mid2-iRFP (TMP, ሰማያዊ)ን እዚ ሃናጺ ERES ምልክት Sec13-mCherry (ERES, magenta) ኣብ 37°C ን30 ደቓይቕ ተሓቢኡ፣ ናብ 24°C፣ ድሕሪ 5 ደቓይቕ ድማ ብ SCLIM ዝተሳእለ። (A to C) ተወካሊ ዝተዋሃሃደ ወይ ንጽል 2D ምስሊ ናይ ሓደ ነፋሪት (A)፣ 2D ፕሮጀክት ምስሊ ናይ 10 z-ክፋላት (B) ወይ 3D ዋህዮ ንፍቀ ክቢ ምስሊ ናይ ጽዕነትን ERES ምልክታትን (C) የርኢ። ስኬል ባር 1μm (A and B)። እቲ ስኬል ኣሃዱ 0.551μm (C) እዩ። Gas1-GFP ኣብ ዲስክሪት ER ዞባታት ወይ ክላስተራት ክርከብ እንከሎ፡ Mid2-iRFP ድማ ኣብ መላእ ER ሽፋን (C) ተረኺቡን ተዘርጊሑን። (D) እቲ ግራፍ ኣብ መስመር ጻዕዳ ቀስቲ (ጸጋም) ኣብ ዝርከብ ክላስተር Gas1-GFPን Mid2-iRFPን ኣንጻራዊ ጽዓት ፍሎረሰንስ የርኢ። AU, ኢደወነናዊ ኣሃዱ። (E and F) ነቲ ኣቑሑትን ምልክት ERESን ዘወሃህድ 3D ምስሊ ይውክሉ። Gas1-GFP ክላስተራት ኣብ ጥቓ እቲ ፍሉይ ERES ተረኺቦም። እቲ ስኬል ኣሃዱ 0.551μm እዩ። (F) እቲ ጻዕዳ ጽኑዕ ፍላጻ ነቲ ምስ ERES ዝተኣሳሰር Gas1-GFP ክላስተር ይሕብር። ኣብ ማእከላይን የማናይን ፓነላት ዝተዋሃሃደ ዝዓበየ 3D ምስልን ዝተዘዋወረ ትርኢት ናይቲ ዝተመርጸ Gas1-GFP ክላስተርን የርእዩ።
ኣብ መንጎ Gas1-GFP ክላስተርን ፍሉይ ERESን ዘሎ ጥቡቕ ቦታዊ ዝምድና፡ Gas1-GFP ናብ ምሩጽ ERES ክኣቱ ከም ዝኽእል ዘመልክት ኮይኑ፡ እዚ ድማ ካብቲ Mid2-iRFP ካብ ER ንምውጻእ ዝጥቀመሉ ምምራጽ ዝተፈልየ እዩ። ነዚ ተኽእሎ ንምፍታሕ ድማ ንሓደ ወይ ክልተ ኣቑሑት ጥራሕ ንሬሽዮ ERES ብቑፅሪ ገይርናዮ (ስእሊ 2፣ ካብ ሀ ክሳብ ሐ)። መብዛሕትኡ ERES (70%) ሓደ ዓይነት ጽዕነት ጥራይ ከም ዝሓዘ ረኺብናዮ። ኣብ ታሕተዋይ ምስሊ ስእሊ 2C ክልተ ልሙዳት ኣብነታት ERES ምስ Gas1-GFP ጥራይ (ስእሊ 1) ወይ Mid2-iRFP ጥራይ (ስእሊ 2) የርኢ። ብኣንጻሩ ኣስታት 20% ካብ ERES ኣብ ሓደ ከባቢ ዝድራረቡ ክልተ ጽዕነት ዝሓዘ እዩ። ገለ ERES (10%) ክልተ ዓይነት ጽዕነት ዝሓዙ ኮይኖም፡ ኣብ ብንጹር ዝተፈላለየ ከባቢታት ግን ተነጺሎም ከምዘለዉ ተረጋጊጹ። ስለዚ እዚ ስታቲስቲካዊ ትንተና ከምዘርእዮ ER ናብ ሰደድ ምስተሰደደ GPI-AP Gas1-GFPን ትራንስሜምብሬን ካርጎ Mid2-iRFPን ኣብ ዝተፈላለዩ ERES ይምቀሉ (ስእሊ 2D)። እዚ ናይ ምፍላይ ብቕዓት ምስቲ ቅድሚ ሕጂ ዝተገብረ ባዮኬሚካላዊ ትንተና (6)ን ሞርፎሎጂካዊ ምውሳንን (7) ኣዝዩ ዝሰማማዕ እዩ። ብተወሳኺ ኣብ ERES ዝኣቱ ውሸባ ዝተገበረሉ ፅዕነት ባህሪ ክንዕዘብ ንኽእል ኢና (ስእሊ 2Eን ፊልም S2ን)። ስእሊ 2E ከምዘርእዮ ንእሽቶ ክፋል Gas1-GFP (ፓነል 3) ወይ Mid2-iRFP (ፓነል 4) ጥራይ እዩ ካብ ሓደ ወገን ናብ ERES ዝኣቱን ኣብ ፍሉይ ቦታ ዝተሓጽረን እዩ። ስእሊ 2E ፓነል 5 ከምዘርእዮ Gas1-GFPን Mid2-iRFPን ሓደ ሓደ ግዜ ኣብ ሓደ ERES ይርከቡ፣ ግን ካብ ዝተፈላለየ ወገን ይኣትዉን ኣብ ዝተፈላለዩ ዞባታት ዝተዋህለሉን ኮይኖም ዝተፈላለዩ COPII ቬሲኩላት ክውክሉ ይኽእሉ። ብተወሳኺ ዝተዓዘብናዮ ምፍላይን ምደባን C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ከም ምሩጽ ERES ፍሉይ ምዃኑ ኣረጋጊጽና ምኽንያቱ ካልእ transmembrane secretion cargo, GFP-tagged ፕላዝማ ሽፋን ፕሮቲን Axl2 (27 ), ተመሳሳሊ ባህሪ ምስ Mid2-iRFP ዘርኢ. (ስእሊ S1ን ፊልም S3ን)። እቲ ሓድሽ ዝተሰነየ Axl2-GFP ብመንገዲ ER ሽፋን ከም Mid2-iRFP (ስእሊ S1, A and B) ይዝርጋሕ፣ ኣብ መብዛሕትኡ ERES ድማ ምስ Mid2-iRFP ብሓባር ይርከብ (ስእሊ S1, B ክሳብ D)። ፓነላት 1ን 2ን ስእሊ 1. S1C ክልተ ልሙዳት ኣብነታት ERES የርኢ ኣብኡ ክልተ ትራንስሜምብሬን ፅዕነት ይድራረቡ። ኣብ ከምዚ ኩነታት ክልቲኦም ኣቑሑት ብሓባር ናብ ERES ይኣትዉ (ስእሊ S1E፣ ፓነል 3ን ፊልም S3ን)።
እቶም sec31-1 ዋህዮታት galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, ቀጠልያ)ን Mid2-iRFP (TMP, ሰማያዊ)ን constitutive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) ዝገልጹ ኣብ 37 ድሕሪ ምሕቃቕ ን30 ደቓይቕ ኣብ °C ተቐሚጦም፣ ናብ 24 °C ብምግዓዝ ነቲ ምፍሳስ ብሎክ ንምፍናው፣ ድሕሪኡ ድማ ምስ SCLIM ምስሊ 20 ደቓይቕ። (A to C) ተወከልቲ 2D ፕሮጀክት ምስልታት (A; ስኬል ባር, 1μm) ወይ 3D ዋህዮ ንፍቀ-ክቢ ምስልታት (B and C; ስኬል ኣሃዱ, 0.456μm) ናይቲ ጽዕነትን 10 z-ክፋላትን ብERES ምልክት ዝተገብረሎም። ኣብ (B) ዘሎ ታሕተዋይ ፓነልን ኣብ (C) ዘሎ ፓነልን ኣብ ERES (ማጀንታ) [Gas1-GFP (ግራጭ)ን Mid2-iRFP (ፍኹስ ዝበለ ሰማያዊ)ን] ዝርከቡ ኣቑሑት ጥራይ ንምርኣይ ዝተመስርሑ ምስልታት የርእዩ። (ሐ) ክፉት ፍላጻ፡ ERES ሓደ ጽዕነት ጥራይ እዩ ዝስከም (ካብ 1 ክሳብ 4)። ግራጭ ፍላጻ፦ ERES ዝተፈለየ ጽዕነት (5) ዝሓዘ እዩ። ጻዕዳ ጽኑዕ ፍላጻ፡ ኣብ ሓደ ቦታ ዝርከብ ጽዕነት ዝሓዘ ERES። ኣብ ታሕቲ፡ እቲ ዝተመርጸ ንጽል ERES Gas1-GFP (1) ወይ Mid2-iRFP (2) ጥራይ ዝሓዘ እዩ። ስኬል ባር፣ 100 ና.ሜ. (መ) ብዝሒ ናይቲ ኣብ (ሐ) ዝተገልጸ ፎቶማይክሮግራፍ። ማእከላይ ሚእታዊት ናይ ERES ሓደ ጽዕነት ጥራይ ዝሓዘ (Gas1-GFP ወይ Mid2-iRFP)፣ ዝተፈለየ ጽዕነትን ዝተደራረበ ጽዕነትን። ኣብ ሰለስተ ነጻ ፈተነታት፡ n=432 ኣብ 54 ዋህዮታት። ናይ ጌጋ ባር = SD. ክልተ ጭራ ዘይተጻምደ t ፈተና. *** P = 0.0002 እዩ። (E) 3D ምስሊ ናይ ዝተመርጹ ERES ናይ ዝተወሸቡ ጽዕነት ብ (C) ዝተለጠፈ። Gas1-GFP (ቀጠልያ) (3) ወይ Mid2-iRFP (ሰማያዊ) (4) ካብ ሓደ ወገን ናብ ERES (magenta) ዝኣቱ ኮይኑ ኣብ ውሽጢ ERES ኣብ ንእሽቶ ቦታ ዝተሓጽረ እዩ። ሓደ ሓደ ግዜ ክልቲኦም ዓይነታት ጽዕነት ካብ ሓደ ወገን ናብ ሓደ ERES (5) ብምእታው ኣብ ውሽጢ ERES ኣብ ዝተነጸለ ቦታ ይሕጸቡ። ስኬል ባር፣ 100 ና.ሜ.
ቀጺልና፡ እቲ ኣብ ER ሽፋን ዝርከብ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ሴራማይድ (C26) ነቲ ፍሉይ ምትእኽኻብን ምፍላይን Gas1 ናብ ምሩጽ ERES ይድርኾ ዝብል ግምታዊ መርገጺ ፈቲንና። ነዚ ንምትግባር ድማ ዝተመሓየሸ ስርዓተ ማይ ብሑቝ GhLag1 ተጠቒምና፣ ኣብኡ እቶም ክልተ ውሽጣዊ ሴራማይድ ሲንተዘስ Lag1ን Lac1ን ብGhLag1 (Lag1 ሆሞሎግ ናይ ጡጥ) ተተኪኦም፣ ውጽኢቱ ድማ ካብ ዱር ዓይነት ዝሓጸረ ዋህዮ ሽፋን ሴራማይድ ጽግዕተኛ ዘለዎ ጽግዕተኛ ማይ ብሑቝ ኮይኑ (ስእሊ 3A) (28)። ትንተና ማስ ስፔክትሮሜትሪ (MS) ከም ዘመልክቶ ኣብ ዱር-ዓይነት ዓይነታት 95% ካብ ጠቕላላ ሴራማይድ ኣዝዩ ነዊሕ (C26) ሰንሰለታዊ ሴራማይድ ክኸውን ከሎ ኣብ GhLag1 ድማ 85% ሴራማይድ ኣዝዩ ነዊሕ (C18ን C16ን) እዩ። ), 2% ጥራይ ካብ ሴራማይድ ኣዝዩ ነዊሕ (C26) ሰንሰለት ሴራማይድ እዩ። ክሳብ ሕጂ ኣብ ሽፋን GhLag1 ዝተረኽቡ ቀንዲ ሴራማይድ C18ን C16ን ሴራማይድ እኳ እንተኾኑ፡ ትንተና MS ኣብ GhLag1 ጽግዕተኛ ዝተገልጸ GPI መልህቕ Gas1-GFP ምስ ዱር ዓይነት ሽኮር ዝወዳደር C26 ሴራማይድ ከም ዝሓዘ እውን ኣረጋጊጹ። እቲ ፅሬት ሓደ እዩ (ስእሊ 3ሀ) (26)። ስለዚ እዚ ማለት እቲ ሴራማይድ ሪሞዴሊንግ ኢንዛይም Cwh43 ንC26 ሴራማይድ ኣዝዩ ምሩጽ እዩ፣ ከምቲ ኣብ ስእሊ 26 ንርእዮ ዘለና፣ ብመምረጺ ካብ ውሑድ መጠን C26 ሴራማይድ ኣብ GhLag1 ጽግዕተኛ GPI መልህቕ የጠቓልል። S2 (29) ዝብል ጽሑፍ ኣሎ። እዚ ከምዚ ኢሉ እናሃለወ፡ ሽፋን ዋህዮታት GhLag1 ብመሰረቱ C18-C16 ሴራማይድ ጥራይ ክሕዝ እንከሎ፡ Gas1-GFP ግን ጌና C26 ሴራማይድ ኣለዎ። እዚ ሓቂ እዚ ነዚ ጽግዕተኛ ብፍሉይ ነቲ ጸገም ናይቲ ኣብ ER ዝርከብ ንውሓት ኣሲል ሰንሰለት ንውሓት ሽፋን ሴራማይድ ንምፍታሕ ምቹእ መሳርሒ ይገብሮ። ግምታዊ ተራ ደርብን ምፍላይን። ድሕሪኡ፡ መጀመርታ ዓቕሚ C26 Gas1-GFP ኣብ GhLag1 ምስ ሙቐት-ተሃዋሲ ምልዋጥ ኣለል sec31-1 ብተለምዶ ፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ፡ ኣብኡ ነዊሕ (C18-C16) ሰንሰለት ጥራይ ኣብ ER ሽፋን Ceramide (ስእሊ. 3) ዝህሉ፡ ኣጽኒዕና። ኣብ sec31-1 መብዛሕትኡ Gas1-GFP ኣብ ክላስተራት ዝተዋህለለ ክኸውን ከሎ፡ Gas1-GFP ኣብ sec31-1 GhLag1 ምስ ነዊሕ (C18-C16) ነዊሕ ሴራማይድ ER ሽፋን ብቐንዱ ኣብ In the entire ER membrane ከምዘይተጠርነፈን ከምዘይተዘርግሐን ተዓዚብና። ብልክዕ ንምዃን፡ C26 ceramide-based clustering ምስ ፍሉይ ERES ብቐረባ ዝተኣሳሰር ስለዝኾነ (ስእሊ 1)፡ ቀጺልና እዚ መስርሕ እዚ ንስራሕ ናይ ER ሰደድ ፕሮቲን መካኒዝም እውን ከጠቓልል ይኽእል ድዩ ዝብል መርሚርናዮ። GPI-AP ንER ሰደድ ፍሉይ COPII ስርዓት ይጥቀም፣ እዚ ድማ ብንጥፈት ብ Ted1′s structural remodeling of the glycan portion of the GPI anchor (30, 31) ዝምራሕ እዩ። እቲ ዳግመ-ውህደት GPI-ግላይካን ድሕሪኡ ብትራንስሜምብሬን ጽዕነት ተቐባሊ p24 ውህደት ይፍለጥ፣ እዚ ብግዲኡ ብመምረጺ Lst1 ይመልመል፣ እዚ ድማ ፍሉይ isoform ናይቲ ዓቢ COPII ጽዕነት መእሰሪ ንኡስ ኣሃዱ Sec24 እዩ፣ GPI-AP-ሃብታም COPII ዝፈጥር ቬሲኩላት ኣድለይቲ እዮም (31-33)። ስለዚ፡ ምድምሳስ ናይዞም ንጽል ፕሮቲናት (the p24 complex component Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 and the specific COPII subunit Lst1) ምስ sec31-1 mutant strain ዘወሃሃደ ድርብ ምልዋጥ ሃኒጽና፡ Gas1-cluster GFP ምፍጣር ይከኣል ድዩ ዝብል ኣጽኒዕናዮ (ስእሊ 3)። ኣብ sec31-1emp24Δን sec31-1ted1Δን Gas1-GFP ብቐንዱ ከምቲ ኣቐዲሙ ኣብ sec31-1 GhLag1 ዝተራእየ ኣብ መላእ ER ሽፋን ዘይተጠርነፈን ዝተዘርግሐን ምዃኑ ተዓዚብናዮ፣ ኣብ sec31-1lst1Δ ድማ Gas1-GFP Like sec31-1። እዞም ውጽኢታት ከም ዘመልክትዎ፡ ብዘይካ ህላወ C26 ceramide ኣብ ER ሽፋን፡ ምትእኽኻብ Gas1-GFP ምስቲ p24 complex ምትእስሳር እውን የድልዮ፡ ከምኡ’ውን ፍሉይ Lst1 ምልመላ ኣየድልዮን። ቀጺልና፡ ኣብ ሽፋን ER ዝርከብ ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ፡ ንመእሰሪ Gas1-GFP ናብ p24 ክቆጻጸር ከም ዝኽእል ተኽእሎ ዳህሲስናዮ። ይኹን እምበር፡ ህላወ C18-C16 ሴራማይድ ኣብቲ ሽፋን፡ ነቶም ብp24 ኮምፕለክስ (ስእልታት S3ን S4ን፡ Aን Bን) ዳግማይ ዝተሃንጹ GPI-glycans ወይ ምስ GPI-AP ምትእስሳርን GPI-AP ናብ ወጻኢ ዝልእኹን ከምዘይጸልዎም ረኺብናዮ። ተኽእሎ። ንኡስ ዓይነት COPII Lst1 ምልመላ (ስእሊ S4C)። ስለዚ፡ ኣብ C26 ሴራማይድ ዝምርኮስ ምትእኽኻብ ምስ ዝተፈላለዩ ER ሰደድ ፕሮቲን ኣገባባት ፕሮቲን ምትእስሳር ኣየድልዮን፡ ግን ከኣ ብንውሓት ሽኮር ዝድረኽ ኣማራጺ ምፍላይ ኣገባብ ይድግፍ። ድሕሪኡ፡ ኣብ ER ሽፋን ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ ኣሲል ንውጽኢታዊ ምደባ Gas1-GFP ከም ምሩጽ ERES ኣገዳሲ ድዩ ኣይኮነን ተንቲንና። ኣብቲ ሓጺር ሰንሰለት ዘለዎ ሴራማይድ ዘለዎ GhLag1 ጽግዕተኛ Gas1 ካብ ER ወጺኡ ናብ ሽፋን ፕላዝማ ስለ ዝኣቱ (ስእሊ S5)፡ እቲ ምፍላይ ብንውሓት ናይቲ ሴራማይድ ኣሲል ሰንሰለት ዝድረኽ እንተኾይኑ፡ እቲ ኣብ GhLag1 ጽግዕተኛ ዘሎ Gas1 ዳግማይ ኣንፈት ክቕየርን ክሰግርን ከም ዝኽእል ንኣምን። ERES ኣቑሑት ምስ ተመሳሳሊ ሽፋን።
(ሀ) ሽፋን ዋህዮታት GhLag1 ብቐንዱ ሓጸርቲ C18-C16 ሴራማይድስ ክሕዝ እንከሎ፡ እቲ GPI መልህቕ ናይ Gas1-GFP ድማ ጌና ከም ናይ በረኻ ዓይነት ዋህዮታት ተመሳሳሊ C26 IPC ኣለዎ። ኣብ ላዕሊ፡ ትንተና ንውሓት ሰንሰለት ኣሲል ሴራማይድ ኣብ ሽፋን ዋህዮ ናይ ዱር-ዓይነት (Wt)ን GhLag1pን ጽግዕተኛታት ብማስ ስፔክትሮሜትሪ (MS)። እቲ ዳታ ንሚእታዊት ጠቕላላ ሴራማይድ ዝውክል እዩ። ማእከላይ ገምጋም ናይ ሰለስተ ነጻ ፈተነታት። ናይ ጌጋ ባር = SD. ክልተ ጭራ ዘይተጻምደ t ፈተና. **** ፒ <0.0001። ታሕተዋይ ፓነል: MS ትንተና ናይ ኣሲል ሰንሰለት ንውሓት ናይ IPC ኣብ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI መልህቕ ኣብ ዱር-ዓይነትን GhLag1p ጽግዕተኛታት ዝተገልጸ. እቲ ዳታ ንሚእታዊት ናይ ጠቕላላ IPC ምልክት ዝውክል እዩ። ብማእከላይ ገምጋም ሓሙሽተ ነጻ ፈተነታት። ናይ ጌጋ ባር = SD. ክልተ ጭራ ዘይተጻምደ t ፈተና. ns, ኣገዳሲ ኣይኮነን። P = 0.9134 እዩ። (B) Fluorescence micrographs of sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ and sec31-1lst1Δ cells expressing galactose-induced Gas1-GFP were incubated at 37°C for 30 minutes and passed down to Perform routine fluorescence microscopy after 24 ዲግሪ ሰንቲግሬድ። ጻዕዳ ፍላጻ፡ ER Gas1-GFP ክላስተር። ክፉት ፍላጻ፡ ዘይተጠርነፈ Gas1-GFP ኣብ ምሉእ ሽፋን ER ተዘርጊሑ ኣሎ፡ እዚ ድማ ናይ ER ባህርያዊ ኒዩክለራዊ ቀለቤት ምልካይ የርኢ። ስኬል ባር፣ 5μm። (ሐ) ብዝሒ ናይቲ ኣብ (ለ) ዝተገልጸ ፎቶማይክሮግራፍ። ማእከላይ ሚእታዊት ናይ ዋህዮታት ምስ ነጥቢ Gas1-GFP ቅርጺ። ኣብ ሰለስተ ነጻ ፈተነታት፡ n≥300 ዋህዮታት። ናይ ጌጋ ባር = SD. ክልተ ጭራ ዘይተጻምደ t ፈተና. **** ፒ <0.0001።
ነዚ ጸገም ብቐጥታ ንምፍታሕ፡ SCLIM visualization of Gas1-GFP and Mid2-iRFP ኣብ GhLag1 ምስ sec31-1 ሙቐት-ተሃዋሲ ምልዋጥ ኣለል (ስእሊ 4ን ፊልም S4ን) ኣካይድና። እቲ ER ኣብ 37°C ተዓቂቡ ብድሕሪኡ ኣብ 24°C ምስተለቐቐ፡ መብዛሕትኡ ሓደስቲ ዝተሰርሑ Gas1-GFP ከምቲ ብተለምዶ ማይክሮስኮፕ ዝተዓዘብናዮ፡ ኣብ መላእ ER ሽፋን ኣይተጠርነፈን ኣይተዘርግሐን (ስእሊ 4, A and B)። ብተወሳኺ ዓብዪ ሚኢታዊ ERES (67%) ኣብኡ ብሓባር ዝርከቡ ክልተ ዓይነት ፅዕነት ዘጠቓልል እዩ (ስእሊ 4D)። ስእሊ 4C ፓነላት 1ን 2ን ክልተ ልሙዳት ኣብነታት ERES ምስ ዝተደራረቡ Gas1-GFPን Mid2-GFPን የርእዩ። ብተወሳኺ ክልቲኦም ኣቑሑት ኣብ ሓደ ERES ተቖፂሮም እዮም (ስእሊ 4E፣ ፓነል 3ን ፊልም S4ን)። ስለዚ ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ ንውሓት ናይቲ ኣብ ER ሽፋን ዝርከብ ሴራማይድ ኣሲል ሰንሰለት፡ ኣገዳሲ ወሰንቲ ምትእኽኻብን ምደባን ፕሮቲን ER እዩ።
Sec31-1 GhLag1 ዋህዮታት ብጋላክቶስ-ዝተደረኸ ምፍሳስ፣ Gas1-GFP (GPI-AP, ቀጠልያ)ን Mid2-iRFP (TMP, ሰማያዊ)ን ከምኡ እውን constitutive ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) ዝገልፁ ኣብ 37°C ይሕብሕቡ። ን30 ደቓይቕ ቀጽል፡ ናብ 24 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ወሪድካ ፍሕኛ ምፍናው፡ ድሕሪ 20 ደቓይቕ ድማ ብSCLIM ምስሊ ምውሳድ። (A to C) ተወከልቲ 2D ፕሮጀክት ምስልታት (A; ስኬል ባር, 1μm) ወይ 3D ዋህዮ ንፍቀ-ክቢ ምስልታት (B and C; ስኬል ኣሃዱ, 0.45μm) ካብቶም 10 z-ክፋላት ብጽዕነትን ERESን ምልክት. ኣብ (B) ዘሎ ታሕተዋይ ፓነልን ኣብ (C) ዘሎ ፓነልን ኣብ ERES (ማጀንታ) [Gas1-GFP (ግራጭ)ን Mid2-iRFP (ፍኹስ ዝበለ ሰማያዊ)ን] ዝርከቡ ኣቑሑት ጥራይ ንምርኣይ ዝተመስርሑ ምስልታት የርእዩ። (ሐ) ጻዕዳ ዝተመልአ ፍላጻ፡ ERES፡ ኣቑሑት ይደራረቡ። ክፉት ፍላጻ፡ ERES ሓደ ኣቕሓ ጥራይ ዝሓዘ እዩ። ታሕተዋይ ፓነል፡- እቲ ዝተመርጸ ERES ኣብ (C) ምልክት ዝተገብረሉ ተደራራቢ ኣቑሑት (1ን 2ን) ኣለዎ። ስኬል ባር፣ 100 ና.ሜ. (መ) ብዝሒ ናይቲ ኣብ (ሐ) ዝተገልጸ ፎቶማይክሮግራፍ። ኣብ sec31-1ን sec31-1ን GhLag1 ኣሃዱታት ሓደ ጽዕነት (Gas1-GFP ወይ Mid2-iRFP) ጥራይ እዩ ዝካተት፣ ከምኡ’ውን ማእከላይ ሚእታዊት ERES ንዝተነጸለ ጽዕነትን ዝተደራረበ ጽዕነትን። ኣብ ሰለስተ ነጻ ፈተነታት፡ n = 432 ኣብ 54 ዋህዮታት (sec31-1)፡ n = 430 ድማ ኣብ 47 ዋህዮታት (sec31-1 GhLag1)። ናይ ጌጋ ባር = SD. ክልተ ጭራ ዘይተጻምደ t ፈተና. *** P = 0.0002 (sec31-1) ከምኡ እውን ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1) እዩ። (E) 3D ምስሊ ናይ ዝተመርጸ ERES ምስ ተደራራቢ ጽዕነት (3) ኣብ (C) ምልክት ዝተገብረሉ። Gas1-GFP (ቀጠልያ)ን Mid2-iRFP (ሰማያዊ)ን ካብ ሓደ ወገን ናብ ERES (magenta) ቀሪቦም ኣብ ሓደ ERES ዝተገደበ ቦታ ይጸንሑ። ስኬል ባር፣ 100 ና.ሜ.
እዚ መጽናዕቲ፡ ስብሒ መሰረት ዝገበሩ ፕሮቲን ጽዕነት ኣብ መንገዲ ምፍሳስ ኣብ ምሩጽ ሰደድ ቦታታት ከም ዝምደቡ ቀጥታዊ ኣብ ውሽጢ ሰብነት መርትዖ ይህብ፡ ከምኡ’ውን ኣገዳስነት ንውሓት ሰንሰለት ኣሲል ንመምረጺ ምደባ የቃልዕ። SCLIM ዝበሃል ሓያልን ምዕቡልን ማይክሮስኮፒ ሜላ ብምጥቃም፡ ነቲ ሓድሽ ዝተሰነየ Gas1-GFP (ኣዝዩ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎ ዓቢ ፕላዝማ ሽፋን GPI-AP ምስ ኣዝዩ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት (C26) ሴራማይድ ሽኮር ክፋል) ኣብ ማይ ብሑቝ ኣርኢናዮ ) እቶም ኣብ ንበይኖም ERs ዝተኣከቡ ዞባታት ምስ ፍሉይ ERES ዝተኣሳሰሩ ክኾኑ ከለዉ፡ ትራንስሜምብሬን ዝፍኖ ፕሮቲናት ድማ ኣብ መላእ ሽፋን ER ይዝርግሑ (ስእሊ 1)። ብተወሳኺ እዞም ክልተ ዓይነት ኣቑሑት ናብ ዝተፈላለየ ERES ብመምረፂ ይኣትዉ (ስእሊ 2)። ንውሓት ሰንሰለት ኣሲል ናይቲ ኣብ ሽፋን ዘሎ ዋህዮኣዊ ሴራማይድ ካብ C26 ናብ C18-C16 ይንኪ፣ እቲ Gas1-GFP ክላስተር ናብቲ ንበይኑ ER ዞባ ይበታተን፣ Gas1-GFP ድማ ብተመሳሳሊ ERES ኣቢሉ ካብቲ ER ምስቲ ትራንስሜምብሬን ፕሮቲን ክወጽእ ዳግማይ ይኸይድ (ስእሊ 3ን ስእሊ 3ን)። 4)።
ዋላ እኳ GPI-AP ካብ ER ንምውጻእ ፍሉይ ፕሮቲን መካኒዝም ይጥቀም እንተኾነ፡ ኣብ C26 ሴራማይድ ዝምርኮስ ምፍላይ ኣብ ፍልልያዊ ፕሮቲን ምትእስሳር ከምዘይምርኮስ ረኺብናዮ እዚ ድማ ናብ ERES ስፔሻላይዜሽን ክመርሕ ይኽእል እዩ (ስእልታት S4ን S5ን)። ኣብ ክንድኡስ፡ ርኽበታትና ብሊፒድ መሰረት ዝገበረ ፕሮቲን ምትእኽኻብን ስዒቡ ዝመጽእ ምግላል ካልኦት ጽዕነትን ዝድረኽ ኣማራጺ ምደባ ኣገባብ ይድግፍ። ትዕዝብትታትና ከም ዘመልክቶ፡ እቲ ምስ ሓደ ፍሉይ ERES ዝተኣሳሰር Gas1-GFP ዞባ ወይ ክላስተር፡ እቲ ብትራንስሜምብሬን ዝፍኖ ፕሮቲን Mid2-iRFP ከም ዝጎደሎ፡ እዚ ድማ እቲ ኣብ C26 ሴራማይድ ዝምርኮስ GPI-AP ክላስተር ናብቲ ዝምልከቶ ERES ንምእታዎም ከም ዘመቻችእ፡ ኣብ ተመሳሳሊ እዋን ድማ፡ ትራንስሜምብሬን ዘግልል The secretions enter this particular ERES (ስእልታት 1ን 2ን) ከም ዝጎድሎ ይሕብር። ብኣንጻሩ ኣብ ሽፋን ER C18-C16 ሴራማይድስ ምህላዎም GPI-AP ዞባታት ወይ ክላስተራት ክፈጥር ስለዘይገብር፡ ብትራንስሜምብሬን ዝፍኖ ፕሮቲናት ናብ ሓደ ዓይነት ERES ኣየግልሉን ወይ ኣይትክኡን እዮም (ስእልታት 3ን 4ን)። . ስለዚ፡ C26 ሴራማይድ ምስ ፍሉይ ERES ዝተኣሳሰሩ ፕሮቲናት ምትእኽኻብ ብምምችቻው ምፍላይን ምደባን ከም ዝድርኽ ሓሳብ ነቕርብ።
እዚ ኣብ C26 ሴራማይድ ዝምርኮስ ምትእኽኻብ ናብ ፍሉይ ER ከባቢ ብኸመይ ንበጽሖ? ሽፋን ሴራማይድ ብጎኒ ናይ ምፍላይ ዝንባለ GPI-APን C26 ሴራማይድን ኣብቲ ዝያዳ ዘይስሩዕ ሽኮር ሃዋህው ናይቲ ዝሓጸሩን ዘይተጸገቡን ግሊሰሮሊፒድ ዝሓዘ ሽፋን ER ንኣሽቱን ብቕጽበት ዝተሰርዑን ሽኮር ክፈጥሩ ክገብሮም ይኽእል። ፅሬት ዘለዎም ክላስተራት (17, 18)። እዞም ንኣሽቱ ግዝያውያን ዕስለታት ምስቲ p24 ኮምፕለክስ ድሕሪ ምትእስሳሮም ብዝያዳ ናብ ዝዓበዩን ዝያዳ ርጉኣትን ዕስለታት ክሕወሱ ይኽእሉ ( 34 ). ምስዚ ዝሰማማዕ፡ C26 Gas1-GFP ምስ p24 complex ምትእስሳር ዓበይቲ ዝረኣዩ ክላስተራት ንምፍጣር ከምዘድልዮ ኣርኢና (ስእሊ 3)። እቲ p24 ኮምፕለክስ ኣብ ማይ ብሑቝ (35) ብኣርባዕተ ዝተፈላለዩ p24 ትራንስሜምብሬን ፕሮቲናት ዝተዋህለለ ሄተሮዛይጎስ ኦሊጎመር ኮይኑ፡ እዚ ድማ ማልቲቫለንት ምትእስሳር ይህብ፡ እዚ ድማ ናብ መስቀላዊ ምትእስሳር ንኣሽቱ GPI-AP ክላስተራት ክመርሕ ይኽእል፡ በዚ ድማ ዝዓበየ Stable ክላስተር (34) ይፈጥር። ኣብ መንጎ ፕሮቲን ኤክቶዶመይን ናይ GPI-APs ዝግበር ምትእስሳር እውን ኣብ ምትእኽኻቦም ኣበርክቶ ክህልዎ ይኽእል እዩ፣ ከምቲ ኣብ መጥበውቲ ፖላራይዝድ ኤፒተልያል ዋህዮታት ኣብ እዋን ጎልጂ መጓዓዝያኦም ዝረአ ( 36 ). ይኹን እምበር፡ C18-C16 ሴራማይድ ኣብ ሽፋን ER ምስ ዝህሉ፡ እቲ p24 ኮምፕለክስ ምስ Gas1-GFP ክተሓሓዝ ከሎ፡ ዓበይቲ ዝተፈላለዩ ዕስለታት ኣይክፍጠሩን እዮም። እቲ መሰረታዊ ኣገባብ ኣብ ፍሉይ ፊዚካውን ኬሚካላውን ባህርያት ናይቲ ነዊሕ ​​ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎ ሴራማይድ ክምርኮስ ይኽእል። ባዮፊዚካዊ መጽናዕትታት ኣርቲፊሻል ሽፋናት ከም ዘመልክቶ፡ ክልቲኦም ነዊሕ (C24)ን ሓጺርን (C18-C16) ኣሲል ሰንሰለታዊ ሴራማይድ ምፍላይ ምዕራፍ ከስዕቡ ይኽእሉ እኳ እንተኾኑ፡ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎም ሴራማይድስ (C24) ጥራይ እዮም ነቲ ፊልም ዳግማይ ቅርጺ ንምሃብ ልዑል Curvatureን ፊልም ምጥዋይን ከስፋሕፍሑ ዝኽእሉ። ብናይ ሓድሕድ መወከሲ (17, 37, 38)። ትራንስሜምብሬን ሄሊክስ ናይ TMED2፡ ናይ Emp24 ሰብኣዊ ሆሞሎግ፡ ኣብ ሳይቶፕላዝማዊ ሎቡላት ምስ C18 ሴራማይድ መሰረት ዝገበረ ስፊንጎማይሊን ብመምረጺ መንገዲ ከም ዝራኸብ ተረጋጊጹ ኣሎ ( 39 ). ሞለኪዩላዊ ዳይናሚክስ (MD) ምምስሳል ብምጥቃም፡ ክልቲኦም C18ን C26ን ሴራማይድስ ኣብ ዙርያ ሳይቶፕላዝማዊ ሎቡላት ናይ Emp24 ትራንስሜምብሬን ሄሊክስ ከም ዝእከቡን ተመሳሳሊ ምርጫታት ከም ዘለዎምን ረኺብናዮ (ስእሊ S6)። እዚ ድማ ትራንስሜምብሬን ሄሊክስ ናይ Emp24 ኣብቲ ሽፋን ዝርከቡ ሽኮር ዘይምዕሩይ ዝርገሐ ከስዕብ ከምዝኽእል ዘመልክት ምዃኑ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ። እዚ ኣብ ቀረባ እዋን ኣብ ዋህዮታት መጥበውቲ ዝተመርኮሰ ውጽኢት እዩ። ተመሳሳሊ ናይ MD ምምስሳል ህላወ ኤተር ሽኮር እውን የርኢ (40) ። ስለዚ ኣብ ክልተ ሎቡላት ER26 ዝርከብ C26 ሴራማይድ ኣብ ከባቢና ዝሃብተመ ምዃኑ ንግምት። ኣብ ሉሚናል ሎቡላት ዝርከብ GPI-AP ብቐጥታ ምስ ማልቲቫለንት p24ን ምውህላል C26 ሴራማይድ ኣብ ከባቢ p24 ኣብ ሳይቶፕላዝማዊ ሎቡላትን ክተሓሓዝ ከሎ፡ ነቲ ምስኡ ዝኸይድ ምትእኽኻብ ፕሮቲንን ምጥምዛዝ ሽፋንን ብኣጻብዕቲ (41) ክፍጠር ከደንፍዕ ይኽእል፡ እዚ ድማ GPI-AP ናብ ምስ ERES ዝቐርቡ ፍሉያት ዞባታት ክፈላለ ይገብር፡ እዚ’ውን ነቲ ልዑል ምጥምዛዝ ዝሕግዝ እዩ። ዞባታት ናይቲ ER ሽፋን (42)። ቅድሚ ሕጂ ዝቐረቡ ጸብጻባት ነቲ ዝቐረበ ኣገባብ ደጊፎምዎ እዮም (43, 44)። ኣብ ፕላዝማ ሽፋን ዝርከቡ ኦሊጎሌክቲናት፣ ረኽሲ ዘስዕቡ ባእታታት ወይ ጸረ-ኣካላት ምስ ሴራማይድ መሰረት ዝገበሩ ግላይኮስፊንጎሊፒድስ (GSL) ዝገብርዎ ብዙሕነት ዘለዎ ምትእስሳር ዓቢ ምትእኽኻብ GSL የበግስ፣ ምፍላይ ምዕራፍ የዕብዮን ምቕያር ምቕያርን ውሽጣዊ ምትእትታውን ሽፋን የስዕብን (44)። ኢዋቡቺ ወዘተ (43) ነዊሕ (C24) ግን ከኣ ሓጸርቲ ዘይኮኑ (C16) ኣሲል ሰንሰለታት ኣብ ዝህልዉሉ እዋን፡ እቲ ምስ GSL ላክቶሲልሴራማይድ ዝተኣሳሰረ ማልቲቫለንት ሊጋንድ፡ ምፍጣር ዓበይቲ ክላስተራትን ሽፋን ምውራርን ከም ዝድርኽን፡ እቲ ሳይቶፕላዝም Lyn-mediated signal transduction on the leaflets ድማ ብኣሲል ሰንሰለታት ኣብ ዝተተሓሓዙ ከም ዝተሓዋወሰን ተረጋጊጹ ኒውትሮፊልስ ዝበሃሉ ምዃኖም ይፍለጥ።
ኣብ መጥበውቲ ፖላራይዝድ ኤፒተልያል ዋህዮታት፡ ምትእኽኻብ ጸረ-ጎልጂ መርበብ (TGN) ክሳብ ደረጃ ኣፒካል ፕላዝማ ሽፋን ምፍላይን ምፍላይን GPI-AP ይቆጻጸር (10, 45)። እዚ ምትእኽኻብ ብGPI-AP oligomerization (36) ዝድረኽ ኮይኑ፡ ኣብቲ ኣብ ማይ-በሰላ እንረኽቦ ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ እውን ክምርኮስ ይኽእል። ዋላ እኳ መጥበውቲ GPI-AP ኣብ ኤተር ሽኮር ዝተመርኮሰ መልህቕ እንተሃለዎ፡ ከምኡ’ውን ኬሚካላዊ ኣቃውምኡ ካብቲ ኣዝዩ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎ ሴራማይድ ኣዝዩ ዝተፈልየ እንተኾነ፡ ኣብ ቀረባ እዋን ዝተገብረ መጽናዕቲ ክልቲኦም ሽኮራት ብፍልቀት ተመሳሳሊ ፊዚካላውን ኬሚካላውን ባህርያት And function ከም ዘለዎም ኣረጋጊጹ (40)። ስለዚ ኣብ ዋህዮታት መጥበውቲ ዝርከብ ክፋል ሽኮር ኤተር ምስቲ ኣብ ማይ ብሑቝ ዝርከብ C26 ሴራማይድ ክመሳሰል ይኽእል እዩ፣ ተራኡ ድማ ምስቲ ኣብ ሽፋን ዘሎ ነዊሕ ሰንሰለት ዘለዎ ሴራማይድ ብምትሕብባር ምትእኽኻብን ምፍላይን GPI-AP ምድንፋዕ እዩ። እዚ ተኽእሎ ገና ብቐጥታ ምፍታን ዘድልዮ እኳ እንተኾነ፡ ቅድሚ ሕጂ ዝተረኽቡ ርኽበታት ምጉዕዓዝ ናይቲ ነዊሕ ​​ኣሲል ሰንሰለት ዘለዎ ሴራማይድ ናብ ኣካል ጎልጂ ብሳይቶፕላዝማዊ ምትሕልላፍ ፕሮቲናት ከምዘይፍጸም፡ ግን ከኣ ኣብ ምትእኽኻብ ከም ማይ-በሰላ ዝኣመሰሉ መልህቕ ጂፒኣይ ከምዝምርኮስ ይድግፉ። ስለዚ እቲ ፍልቀት ዓቃባዊ ኣገባብ ኣዝዩ ነዊሕ ኣሲል ሰንሰለት ሴራማይድን ጂፒኣይ-ኤፒን (13, 16, 20, 46, 47) ኣብ ሓደ ዓይነት መጓዓዝያ ቬሲክል ብመምረጺ ሓባራዊ መጓዓዝያ ክገብር ዝኽእል ይመስል።
ኣብ ስርዓታት ዋህዮታት ማይ ብሑቝን መጥበውትን ፖላራይዝድ ኤፒተልያል፡ ምትእኽኻብን ምፍላይን GPI-AP ካብ ካልኦት ፕሮቲናት ሽፋን ፕላዝማ ኩሎም ቅድሚ ናብ ገጽ ዋህዮ ምብጽሖም ይፍጸሙ። ፓላዲኖን ካልኦትን. (48) ኣብ TGN ናይ መጥበውቲ ፖላራይዝድ ኤፒተልያል ዋህዮታት፡ GPI-AP ምትእኽኻብ ንመምረጺ ምደባ GPI-APs ናብ ኣፒካል ፕላዝማ ሽፋን ኣድላዪ ጥራይ ዘይኮነ፡ ንውዳበ ምትእኽኻብ GPI-APsን ስነ-ህይወታዊ ንጥፈታቱን እውን ከም ዝቆጻጸር ረኺቦም። ገጽ ዋህዮ። ኣብ ማይ-በሰላ፡ እዚ መጽናዕቲ ከም ዘመልክቶ፡ እቲ ኣብ ER ዝርከብ ኣብ C26 ሴራማይድ ዝምርኮስ GPI-AP ክላስተር፡ ኣብ ሽፋን ፕላዝማ ዝርከብ ውዳበ ክላስተርን ተግባራዊ ንጥፈታትን GPI-AP ክቆጻጸር ከም ዝኽእል ኣርእዩ (24, 49)። ምስዚ ሞዴል ዝሰማማዕ፡ ዋህዮታት GhLag1 ንGPI ተዓጻጸፍቲ ወይ ንጽህና መንደቕ ዋህዮታት ዝጸልዉ መድሃኒታት ኣለርጂ ኣለዎም (28)፡ ኣድላይነት ተግባራዊ Gas1-GFP ክላስተራት (49) ናይቲ ኣብ ምጽንባር ዋህዮታት ማይ-በሰላ ዝተተንበየ ጫፍ ሴራማይድ ድማ G ክኸውን ዝኽእል ፊዚዮሎጂካዊ ሳዕቤናት ዋህዮታት hLag1 የመልክት። GPI-AP ጌጋ። ይኹን እምበር፡ ተግባራዊ ኣወዳድባ ገጽ ዋህዮ ካብ ER ብመገዲ ምፍላይ ኣብ ንውሓት ሽኮር ዝተመርኮሰ ፕሮግራም ተገይሩ ድዩ ኣይተገብረን ዝብል ተወሳኺ ምፍታን፡ ኣርእስቲ መጻኢ መጽናዕትና ክኸውን እዩ።
ኣብዚ ስራሕ ዝተጠቕሙ ዓይነታት ሳካሮማይሰስ ሴረቪዥያ ኣብ ሰሌዳ S1 ተዘርዚሮም ኣለዉ። ንህያው ዋህዮ ምስሊ ዝውዕሉ MMY1583ን MMY1635ን ዝበሃሉ ዓይነታት SCLIM ኣብ ድሕረ ባይታ W303 ዝተሃነፁ እዮም። እዞም Sec13-mCherry ብፍሎረሰንት ፕሮቲን መለለዪ ዝገልጹ ጽግዕተኛታት ኣብ ፖሊሜረዝ ሰንሰለታዊ ምላሽ (PCR) ዝተመርኮሰ ኣገባብ ብpFA6a ፕላስሚድ ከም ቅጥዒ ተጠቒሞም እዮም ተሃኒጾም (23)። እቲ ኣብ ትሕቲ ቁጽጽር GAL1 ፕሮሞተር ብፍሎረሰንት ፕሮቲን ዝተለጠፈ Mid2-iRFP ዝገልጽ ጽግዕተኛ ብኸምዚ ዝስዕብ ተሃኒጹ። PCR ምዕባይ ናይ iRFP-KanMx መስርዕ ካብ pKTiRFP-KAN ቬክተር (ህያብ ናይ E. O'Shea, Addgene ፕላስሚድ ቁጽሪ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; መጽናዕታዊ ጸጋ መለለዪ (RRID): Addgene_64687) ከምኡውን ኣብ C-terminus ናይ endogenous Mid2 ተኣትዩ። እቲ Mid2-iRFP ጂኖም መስርዕ ተዓብሊሉ ናብ GAL1 ፕሮሞተር ክሎን ምስ ተገብረ፡ ኣብቲ Not I-Sac I ሳይት ናይቲ ውህደት ፕላስሚድ pRS306 ተዋሃሂዱ። እቲ ዝረኸብናዮ ፕላስሚድ pRGS7 ምስ Pst I መስመራዊ ተገይሩ ናብ URA3 ሎከስ ክውሃሃድ ተገይሩ።
እቲ Gas1-GFP ፍዩዥን ጂን ኣብ ትሕቲ ቁጽጽር ናይቲ GAL1 ፕሮሞተር ኣብ ሴንትሮሜር (CEN) ፕላስሚድ ይግለጽ፡ እዚ ድማ ከምዚ ዝስዕብ ይህነጽ። እቲ Gas1-GFP መስርዕ ካብ pRS416-GAS1-GFP ፕላስሚድ (24) (ህያብ L. Popolo) ብPCR ተዓብሊሉ ናብ Xma I–Xho I ቦታ ናይ CEN ፕላስሚድ pBEVY-GL LEU2 (ህያብ C) ክሎን ተገይሩ። ሚለር፤ ኣድጂን ፕላስሚድ ቁጽሪ 51225፤ http://n2t.net/addgene: 51225፤ RRID: ኣድጀን_51225) ዝብል ጽሑፍ ኣሎ። እቲ ዝተረኽበ ፕላስሚድ pRGS6 ተባሂሉ ተሰምየ። እቲ Axl2-GFP ፍዩዥን ጂን እውን ኣብ ትሕቲ ቁፅፅር GAL1 ፕሮሞተር ናይቲ pBEVY-GL LEU2 ቬክተር ይግለፅ፣ ህንፀቱ ድማ ከምዚ ዝስዕብ እዩ። እቲ Axl2-GFP መስርዕ ካብ pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ፕላስሚድ (23) ብPCR ተዓብሊሉ፣ ናብ Bam HI-Pst I ሳይት ናይ pBEVY-GL LEU2 ቬክተር ክሎን ተገይሩ። እቲ ዝረኸብናዮ ፕላስሚድ pRGS12 ተባሂሉ ተሰምየ። ኣብዚ መፅናዕቲ ዝተጠቐምናሎም ኦሊጎኑክሊዮታይድስ ቅደም ተኸተል ኣብ ሰሌዳ S2 ተዘርዚሩ ኣሎ።
እቲ ጽላት ብ0.2% ኣዴኒንን 2% ግሉኮስን [YP-dextrose (YPD)]፣ 2% ራፊኖስ [YP-raffinose] ሃብታም ማይ ብሑቝ ምውጻእ ፕሮቲን p (YP) ማእከላይ (1 % ማይ ብሑቝን 2% ፕሮቲን eptን) ተመሊኡ። (YPR)] ወይ 2% ጋላክቶስ [YP-galactose (YPG)] ከም ምንጪ ካርቦን፣ ወይ ኣብ ስነ-ጥበባዊ ዝተሓተ ማእከላይ (0.15% ማይ-በሰላ ናይትሮጅን መሰረትን 0.5% ኣሞንየም ሳልፌትን) ንመግቢ ዘድልዩ ግቡእ ኣሚኖ ኣሲዳትን ቤዛትን ንምምላእ , ከምኡ’ውን 2% ግሉኮስ (ስነ-ጥበባዊ ግሉኮስ ዝተሓተ ማእከላይ) ወይ 2% ጋላክቶስ ዝሓዘ (ስነ-ጥበባዊ ጋላክቶስ ዝተሓተ ማእከላይ) ከም ምንጪ ካርቦን እዩ።
ንሓቀኛ ግዜ ምስሊ፡ ኣብ ትሕቲ GAL1 ፕሮሞተር ነቲ ህንጻ ዝገልጹ ሙቐት-ተሃዋሲ sec31-1 ምልዋጥ ዋህዮታት ኣብ YPR ማእከላይ ኣብ 24 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ንሓደ ለይቲ ክሳብ ማእከላይ ሎግ ምዕራፍ ዓብዮም። ድሕሪ ምልዕዓል ኣብ YPG ኣብ 24°C ን1 ሰዓት፡ እቶም ዋህዮታት ኣብ SG ኣብ 37°C ን30 ደቓይቕ ተሓቢኦም፡ ድሕሪኡ ናብ 24°C ተሰጋጊሮም ካብቲ ምፍሳስ ብሎክ ተፈቲሖም። ኮንካናቫሊን ኤ ነቶም ዋህዮታት ኣብ ብርጭቆ ስላይድ ንምጽጋን ተጠቒሙ ብSCLIM ምስሊ ተሳኢሉ። SCLIM ውህደት ናይ ኦሎምፒስ IX-71 ተገልቢጡ ፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕን UPlanSApo 100×1.4 ቁጽራዊ ኣፐርቸር ዘይቲ ሌንስ (ኦሊምፑስ)፣ ልዑል ፍጥነትን ልዑል-ሲግናል-ን-ድምጺ ሬሽዮ ዝዘውር ዲስክ ኮንፎካል ስካነር (ዮኮጋዋ ኤሌክትሪክ)፣ ብሕታዊ ስፔክትሮሜተር፣ ከምኡ’ውን ብሕታዊ ምዝሓል The system’s image intensifier (Hamamatsu ፎቶኒክስ) ናይ መወዳእታ ማግኒፊኬሽን ×266.7 ዘለዎ ማግኒፋይንግ ሌንስ ሲስተምን ኤሌክትሮናት ዘባዝሕ ቻርጅ ዝተተሓሓዘ መሳርሒ ካሜራን (ሃማማትሱ ፎቶኒክስ) (21) ክህብ ይኽእል። ምስሊ ምእካብ ብሕታዊ ሶፍትዌር (ዮኮጋዋ ኤሌክትሪክ) ይፍጸም። ን3D ምስልታት፡ ብፍቓድና ዝተሰርሐ ፒዞኤሌክትሪክ ኣክቱዌተር ተጠቒምና፡ ነቲ ዕላማዊ ሌንስ ብቐጥታ ንምንቅጥቃጥ፡ ነቶም ብርሃናዊ ክፍልታት ድማ 100 ና.ሜ ተፈላልዮም ኣብ ስታክ ኣኪብናዮም። እቲ Z-stack ምስሊ ናብ 3D ቮክሰል ዳታ ይቕየር፣ እቲ ንዝዘውር ዲስክ ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ዝጥቀመሉ ክልሰ-ሓሳባዊ ነጥቢ ዝርገሐ ፋንክሽን ድማ ብቮሎሲቲ ሶፍትዌር (PerkinElmer) ንመስርሕ ዲኮንቮሉሽን ይጥቀመሉ። ንናይ ሓባር ቦታ ትንተና ብኣውቶማቲክ ደረት ንምግባር ቮሎሲቲ ሶፍትዌር ብምጥቃም ጽዕነት ሓዊሱ ERES ተለኪዑ። ትንተና መስመር ስካን ሜታሞርፍ ሶፍትዌር (ሞለኪዩላር ዲቫይስስ) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ስታቲስቲካዊ ትርጉም ንምፍላጥ ግራፍፓድ ፕሪዝም ሶፍትዌር ምጥቃም። ንኽልተ ጭራ ዘለዎ Student’s t-testን ተራ ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ (ANOVA) testን፡ ኣብ መንጎ ጉጅለታት ዘሎ ፍልልይ ኣብ P <0.05 (*) ርኡይ ጽልዋ ከም ዘለዎ ይቑጸር።
ንፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ ናይ Gas1-GFP፡ እቶም ሎግ ፌዝ ዋህዮታት ኣብ YPD ንሓደ ለይቲ ዓብዮም ብሴንትሪፉጌሽን ተኣኪቦም፡ ክልተ ግዜ ብፎስፌት ዝተዓሸገ ጨው ተሓጺቦም፡ ብውሑዱ ን15 ደቓይቕ ኣብ በረድ ተሓቢኦም፡ ድሕሪኡ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ኣብ ትሕቲ ማይክሮስኮፕ ቀጺሎም ቼክ (24)። ንመግዛእቲ ድማ ብኦብጀክቲቭ ሌንስ፣ L5 (GFP) ፍልተር፣ ሃማማትሱ ካሜራን ኣፕሊኬሽን ሱት ኤክስ (LAS X) ሶፍትዌርን ዝተዓጠቐ Leica DMi8 ማይክሮስኮፕ (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ተጠቒሙ። .
እቶም ናሙናታት ብSDS sample buffer ኣብ 65°C ን10 ደቓይቕ ዲናቸር ተገይሮም፣ ድሕሪኡ ብSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) ተፈላልዮም። ንኢሚኖብሎቲንግ ትንተና ኣብ ነፍሲ ወከፍ መስመር 10 μl ናሙና ተጻዒኑ። ቀዳማይ ጸረ-ኣካል፡- ናይ ራቢት ፖሊክሎናል ጸረ-Gas1 ብ1:3000 ምፍሳስ፡ ናይ ራቢት ፖሊክሎናል ጸረ-Emp24 ብ1:500 ምፍሳስ፡ ከምኡ’ውን ናይ ራቢት ፖሊክሎናል ጸረ-GFP (ህያብ ካብ H. Riezman) ብ1:3000 ምፍሳስ ምጥቃም። እቲ ናይ ኣንጭዋ ሞኖክሎናል ጸረ-Pgk1 ጸረ-ኣካል ብ1:5000 ምፍሳስ (ካብ J. de la Cruz ዝተዋህበ ህያብ) ተጠቒሙ። ካልኣዊ ጸረ-ኣካል፡- ሆርሰራዲሽ ፐሮክሳይድ (HRP) ዝተሓዋወሰ ምራኽ ጸረ-ራቢት ኢሙኖግሎቡሊን G (IgG) ኣብ 1:3000 ምፍሳስ ዝጥቀም (ፒርስ)። HRP-conjugated goat anti-mouse IgG ኣብ ምፍሳስ 1:3000 (ፒርስ) ተጠቒሙ። እቲ ናይ ሕማም ምክልኻል ምላሽ ዞባ ብኬሚሉሚነሰንስ ሜላ ሱፐርሲግናል ዌስት ፒኮ ሪኣጀንት (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) ተዓዚብና።
ከምቲ ኣብ (31) ዝተገልጸ፡ ኣብቲ ዝተሃብተመ ክፋል ER ተፈጥሮኣዊ ናይ ኢሚኖፕረሲፒቴሽን ፈተነ ተኻይዱ። ብሓፂሩ ዋህዮታት ማይ ብሑቕ ብTNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and protease inhibitor mixture) ኣብ 600 nm ( OD600) ኣብ 100 optical density ክልተ ግዜ ምሕፃብ። ብናይ ብርጭቆ ምልክት ተሰባቢሩ፣ ድሕሪኡ እቲ ፍርስራስ ዋህዮታትን ብርጭቆ ምልክትን ብሴንትሪፉጌሽን ተኣልዩ። ብድሕሪኡ እቲ ኣብ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ኣብ 17,000 ግ ን15 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሩ። እቲ ሽጉርቲ ኣብ TNE ዳግማይ ተዓጽዩ ዲጂታሊስ ሳፖኒን ተወሰኸሉ ክሳብ ናይ መወዳእታ ትሕዝቶ 1%። እቲ ስንብራት ን1 ሰዓት ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ እናተዘዋወረ ተሓቢኡ፣ ድሕሪኡ እቶም ዘይፈስሱ ባእታታት ብሴንትሪፉጌሽን ኣብ 13,000 ግ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን60 ደቓይቕ ተኣልዮም። ንGas1-GFP immunoprecipitation መጀመርታ ነቲ ናሙና ብባዶ ኣጋሮስ ቢድስ (ChromoTek) ኣብ 4°C ን1 ሰዓት ቅድመ-ምሕቃቕ፡ ድሕሪኡ ምስ GFP-Trap_A (ChromoTek) ኣብ 4°C ን3 ሰዓታት ምሕቃቕ። እቶም ኢሚኖፕረሲፒተትድ ቢድስ ብ0.2% ዳይጎክሲጀኒን ዝሓዘ TNE ሓሙሽተ ግዜ ተሓፂቦም ብSDS sample buffer ተሓፂቦም ኣብ SDS-PAGE ተፈላልዮም ብኢሙኖብሎቲንግ ተተንቲኖም እዮም።
ከምቲ ኣብ (31) ዝተገልጸ፡ መስቀላዊ ምትእስሳር ምውሳን ኣብቲ ዝሃብተመ ER ክፋል ተኻይዱ። ብሓፂሩ እቲ ዝተሃብተመ ክፋል ER ምስ 0.5 ሚሊ ሜትር ዲቲዮቢስ(ሱክሲኒሚዳይል ፕሮፒዮኔት) (ፒርስ፣ ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ሮክፎርድ፣ ኣይኤል፣ ኣሜሪካ፤ 20 ዲግሪ ሰንቲግሬድ፣ 20 ደቓይቕ) ተሓቢኡ። እቲ ናይ መስቀላዊ ምትእስሳር ምላሽ ግላይሲን (50 ሚሊ ሜትር ናይ መወዳእታ ትሕዝቶ፣ 5 ደቓይቕ፣ 20 ዲግሪ ሰንቲግሬድ) ብምውሳኽ ተዓጽዩ።
ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ (50)፡ MS ትንተና ሴራማይድ ኣብ ዱር-ዓይነትን GhLag1ን ጽግዕተኛታት ተኻይዱ። ብሓፂሩ ዋህዮታት ኣብ YPD ኣብ 30 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ናብ ኤክስፖነንሻል ፌዝ (3 ክሳብ 4 OD600 ኣሃዱታት/ሚሊ ሊትር) ዓብዮም፣ 25×107 ዋህዮታት ድማ ተዓፂዶም። ምትሕልላፍ ምግቦም ብትራይክሎሮኣሴቲክ ኣሲድ ይጠፍእ እዩ። ናይ ምውጻእ መፍትሒ [ኤታኖል፣ ማይ፣ ኤተር፣ ፒሪዲንን 4.2 N ኣሞንየም ሃይድሮክሳይድን (15:15:5:1:0.018 v/v)] ከምኡ’ውን 1.2 nmol ውሽጣዊ ደረጃ C17 ሴራማይድ (860517, Avanti polar lipid) ጽሬት) ምጥቃም። ሞኖሜቲላሚን ሪኣጀንት [ሜታኖል፣ ማይ፣ ኤን-ቡታኖልን ሜቲላሚን ፍታሕን (4:3:1:5 v/v)] ተጠቒምካ ልኡም ኣልካላይን ሃይድሮላይሲስ ናይቲ ቅብኣት ምፍጻም፣ ድሕሪኡ ብማይ ዝተጸገበ n-ቡታኖል ተጠቒምካ ጨው ምእላይ። ኣብ መወዳእታ እቲ ቅብኣት ኣብ ኣወንታዊ ሞድ መፍትሒ [ክሎሮፎርም/ሜታኖል/ማይ (2:7:1) + 5 ሚሊ ሜትር ኣሞንየም ኣሴቴት] ዳግማይ ተዓጽዩ ናብቲ ማስ ስፔክትሮሜተር ተዋጊኡ። ንሞለኪዩላት ስፊንጎሊፒድ ንምልላይን ንምቑጻርን ብዙሕ ግብረመልሲ ምክትታል (MRM) ተኻይዱ። TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ንትንተና ሽኮር ዝኸውን ሮቦታዊ ናኖፍሎው ኣዮን ምንጪ Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ዝተዓጠቐ እዩ። እቲ ናይ ምግጫው ጸዓት ንነፍሲ ​​ወከፍ ምድብ ሴራማይድ ዝምችእ እዩ። MS ዳታ ብፖዚቲቭ ሞድ እዩ ተረኺቡ። ንነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም፡ እቲ ምልክት ሽኮር ማእከላይ ናይ ሰለስተ ነጻ መለክዒታት እዩ።
ከምቲ ኣብ (31) ዝተገልጸ፡ እቶም Gas1-GFP ዝገልጹ ዋህዮታት (800×107) ተፈጥሮኣዊ ኢሚኖፕረሲፒቴሽን ተገይሩሎም። እቲ ዝተፀረየ Gas1-GFP ብSDS-PAGE ተፈልዩ ናብ ፖሊቪኒሊደን ፍሎራይድ (PVDF) ሽፋን ተሰጋጊሩ። እቲ ፕሮቲን ንፒቪዲኤፍ ብኣሚድ ጸሊም ብምልካይ ብስእሊ ተራእዩ። እቲ Gas1-GFP ባንድ ካብ PVDF ተቖሪጹ 5 ግዜ ብሜታኖል ሓደ ግዜ ድማ ብፈሳሲ ክሮማቶግራፊ-MS (LC-MS) ደረጃ ማይ ተሓጺቡ። ነቲ ሽፋን ስትሪፕ ምስ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)፣ መከላኸሊን 500μl ሓድሽ ዝፈሰሰ 1 M ሶድየም ናይትራይት ምትሕውዋስን ኣብ 37°C ን3 ሰዓታት ብምሕቃቕ እቲ ክፋል ሽኮር ካብ Gas1-GFP ይለቐቕን lysed Release of inosine phosphate ceramide between glucosamine and inositol (51) ይግበር። ብድሕሪኡ እቲ ሽፋን ስትሪፕ ብኣርባዕተ ግዜ ብLC-MS ደረጃ ማይ ተሓፂቡ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ነቒፁ ኣብ ናይትሮጅን ሃዋህው ኣብ -80 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ክሳብ ትንተና ተዓቂቡ። ከም ቁጽጽር ንነፍሲ ​​ወከፍ ፈተነ ባዶ ናሙና ሽፋን ፒቪዲኤፍ ተጠቒሙ። ብድሕሪኡ ካብ Gas1-GFP ዝተቐድሐ ሽኮር ከምቲ ዝተገልጸ ብMS ተተንቲኑ (50)። ብሓጺሩ፡ GPI-lipid ዝሓዙ PVDF ስትሪፕስ ኣብ 75μl ኣሉታዊ ቅርጺ መፍትሒ [ክሎሮፎርም/ሜታኖል (1:2) + 5 mM ኣሞንየም ኣሴቴት] ዳግማይ ተዓጽዮም፡ ኤሌክትሮስፕራይ ኣዮናይዘሽን (ESI)-MRM/MS ትንተና ዓይነታት ስፊንጎሊፒድ (TSQ Vantage) ሓሊፎም። ኣብዚ ጉዳይ እዚ MS ዳታ ኣብ ኣሉታዊ ኣዮን ሞድ እዩ ተረኺቡ።
ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ፡ እቲ ሽኮራዊ ክፋል ናይቲ GPI መልህቕ ካብቲ [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16) ተፈልዩ። እቶም ሽኮራት ብቐጢን ንጣብ ክሮማቶግራፊ ብመፍትሒ ስርዓት (55:45:10 ክሎሮፎርም-ሜታኖል-0.25% KCl) ተጠቒሞም ተፈልዮም FLA-7000 (Fujifilm) ተጠቒሞም ብስእሊ ተራእዮም።
እቶም Gas1-GFP (600×107) ዝገልጹ ዋህዮታት ክልተ ግዜ ብTNE buffer ብTNE buffer ተሓጺቦም፣ ብብርጭቆ ምልክት ተሰቢሮም፣ ድሕሪኡ ድማ ፍርስራስ ዋህዮታትን ብርጭቆ ምልክትን ንምእላይ ብሴንትሪፉጅ ተገይሮም እዮም። ብድሕሪኡ እቲ ኣብ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ኣብ 17,000 ግ ን1 ሰዓት ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሩ። እቲ ሽጉርቲ ኣብ TNE ተሓፂቡ ብ1 U PI-PLC (Invitrogen) ኣብ TNE 0.2% digitalis saponin ዝሓዘ ን1 ሰዓት ኣብ 37°C ተሓቢኡ። ድሕሪ ምሕካም ኢንዛይም እቲ ሽፋን ብሴንትሪፉጌሽን ኣብ 17,000 ግ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን1 ሰዓት ተኣልዩ። Gas1-GFP immunoprecipitate ንምግባር፡ እቲ ልዕሊ ማይ ምስ GFP-Trap_A (ChromoTek) ኣብ 4°C ንሓደ ለይቲ ተሓቢኡ። እቲ ብSDS-PAGE ዝተፈለየ ዝተፀረየ Gas1-GFP ብCoomassie brilliant blue ተለኺዩ እዩ። እቲ Gas1-GFP staining band ካብቲ aqueduct ዝኸበበ ግራጭ ተቖሪጹ፡ ድሕሪኡ ብ iodoacetamide ኣልካይለሽን ብdithiothreitol ምጉዳልን ብትሪፕሲን ኣብ ውሽጢ ጀል ምሕቃቕ ተኻይዱ። ትሪፕቲክ ፔፕታይድስን ፔፕታይድስን ብጂፒኣይ-ግላይካን ኣውጺእካ ምንቃጽ። እቲ ዝነቐጸ ፔፕታይድ ኣብ 20 ማይክሮ ሊትር ማይ ፈሲሱ። ኣብቲ LC ሓደ ክፋል (8μl) ምውጋእ። ኣብ ትሕቲ ፍሉይ ኩነታት ምዕባለ ፔፕታይድስ ንምፍላይ ኦክታዴሲልሲላን (ODS) ዓምዲ (Develosil 300ODS-HG-5; ውሽጣዊ ዲያሜትር 150 ሚ.ሜ×1.0 ሚ.ሜ; ኖሙራ ኬሚካል፣ ፕረፈክቸር ኣይቺ፣ ጃፓን) ተጠቒሙ። እቲ ተንቀሳቓሲ ምዕራፍ መፍትሒ A (0.08% ፎርሚክ ኣሲድ)ን መፍትሒ B (0.15% ፎርሚክ ኣሲድ ኣብ 80% ኣሲቶኒትራይል)ን እዩ። Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ተጠቒምካ ነቲ ዓምዲ ብመፍትሒ A ኣብ ውሽጢ 55 ደቓይቕ ብፍሰት 50 μl min-1 ን5 ደቓይቕ ምሕጻብ ተኻይዱ፣ ድሕሪኡ ድማ ትሕዝቶ መፍትሒ B ናብ 40% ክዓቢ ተገይሩ። ፣ ሕቡራት መንግስታት ኣመሪካ)። እቲ ኤሉዌት ብቐጻሊ ናብ ምንጪ ኣዮን ESI ተኣታትዩ፣ እቶም ትሪፕቲክ ፔፕታይድስን ምስ GPI-ግላይካን ዘለዎም ፔፕታይድስን ድማ ብLTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific) ተተንቲኖም። ኣብቲ ናይ MS ኣወዳድባ ቮልቴጅ ናይቲ ምንጪ ሻምብቆታት ደም ናብ 4.5 ኪሎ ቮልት ተቐሚጡ፣ ሙቐት ናይቲ ምትሕልላፍ ሻምብቆታት ድማ ኣብ 300 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተቐሚጡ። ናይ ካፒላሪ ቮልቴጅን ናይ ቱቦ ሌንስ ቮልቴጅን ብቕደም ተኸተል 15 ቮልን 50 ቮልን ተቐሚጡ። MS ዳታ ኣብ ኣወንታዊ ኣዮን ሞድ (ርዝነት 60,000፤ ጅምላ ልክዕነት 10 ክፋላት ኣብ ሚልዮን) ኣብ 300/m/z ጅምላ/ቻርጅ ሬሽዮ (m/z) 3000 ዝተረኽበ እዩ።እቲ MS/MS ዳታ ብመንገዲ ኣዮን መጻወድያ ኣብ LTQ Orbitrap XL [እቲ ዳታ ዝምርኮሰሎም ቀዳሞት 3 ኣሃዛት፣ ምግጫው ዝፈጠሮ ምፍንጫል እዩ ዝተረኽበ (CID)] ዝብል ጽሑፍ ኣሎ።
MD simulations GROMACS (52) ሶፍትዌርን MARTINI 2 force field (53-55)ን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። ብድሕሪኡ CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ተጠቒምካ ዲዮሊዮይልፎስፋቲዲልኮሊን (DOPC)ን Cer C18ን ወይ DOPCን Cer C26ን ዝሓዘ ክልተ ንጣብ ንምህናጽ ተኻኢሉ። ቶፖሎጂን ኮርዲኔትን Cer C26 ካብ DXCE ዝተረኽበ ኮይኑ ካብ ጭራ ስፊንጎሳይን ተወሳኺ ምልክት ብምእላይ እዩ። ነቲ ድርብ ንጣብ ሚዛን ንምሃብን ንምስራሕን ኣብ ታሕቲ ተገሊጹ ዘሎ መስርሕ ተጠቐም፣ ድሕሪኡ ናይ መወዳእታ ኮርዲኔት ናይቲ ስርዓት ተጠቒምካ Emp24 ዝሓዘ ስርዓት ንሃንጽ። እቲ ትራንስሜምብሬን ዶመይን ናይ ማይ ብሑቝ Emp24 (ተረፍ 173 ክሳብ 193) ከም α-ሄሊክስ ብቪዥዋል MD (VMD) መሳርሒ ሞለኪዩላዊ ኣቃውማ (58) ተጠቒሙ ተሃኒጹ። ብድሕሪኡ፡ እቶም ዝተደራረቡ ሽኮራት ድሕሪ ምእላይ፡ እቲ ፕሮቲን ብረጒድ መልክዑ ተቐይሩ፡ CHARMM GUI ተጠቒሙ ናብቲ ክልተ ንጣብ ተኣትዩ። እቲ ናይ መወዳእታ ስርዓት 1202 DOPCን 302 Cer C26ን ወይ 1197 DOPCን 295 Cer C18ን Emp24ን ዝሓዘ እዩ። ነቲ ስርዓት ናብ 0.150M ምትእኽኻብ ኣዮን ምግባር። ንኽልተ ክልተ ንጣብ ውህደታት ኣርባዕተ ነጻ ምድግጋማት ተገይሮም እዮም።
እቲ lipid bilayer ዝበሃል መስርሕ CHARMM GUI ተጠቒምካ ሚዛናዊ ይኸውን፣ እዚ ድማ 405,000 ስጉምትታት ምጉዳልን ድሕሪኡ ሚዛን ምሃብን ዘጠቓልል ኮይኑ፣ ኣብዚ እቲ ናይ ኣቀማምጣ ደረታት በብቑሩብ ይንኪን ይውገድን፣ እቲ ናይ ግዜ ስጉምቲ ድማ ካብ 0.005 ps ናብ 0.02 ps ይውስኽ። ድሕሪ ሚዛን 6 μs ምስ ናይ ግዜ ስጉምቲ 0.02 ps የፍሪ። ድሕሪ Emp24 ምእታው፡ ነቲ ስርዓት ንምንካይን ንምምዛንን ተመሳሳሊ መስርሕ CHARMM GUI ተጠቐም፡ ድሕሪኡ ን8 s ኣብ ምፍራይ ንሰርሕ።
ንኹሎም ስርዓታት ኣብ እዋን መስርሕ ሚዛን እቲ ጸቕጢ ብቤረንደንሰን ባሮስታት (59) ይቆጻጸር፣ ኣብ መስርሕ ምፍራይ ድማ እቲ ጸቕጢ ብፓሪነሎ-ራህማን ባሮስታት (60) ይቆጻጸር። ኣብ ኩሉ ኩነታት ማእከላይ ጸቕጢ 1 ባር ኮይኑ ፍርቂ ኣይሶትሮፒክ ጸቕጢ ምትእስሳር ስኬም ይጥቀም። ኣብ መስርሕ ሚዛንን ምፍራይን፡ ፍጥነት ዳግመ ምዕቃን ዘለዎ ተርሞስታት (61) ንሙቐት ፕሮቲን፣ ሽኮርን መፍትሕን ንጥረ ነገራት ብቕደም ተኸተል ንምትእስሳር ይጥቀም። ኣብ ምሉእ እቲ ስርሒት እቲ ዕላማ ዝኾነ ሙቐት 310K እዩ። እቲ ዘይተኣሳሰር ምትእስሳር 0.005 መከላኸሊ ተጻዋርነት ዘለዎ ቨርሌት ስኬም ተጠቒምካ ናይ ምጽምባር ዝርዝር ብምፍጣር እዩ ዝሕሰብ። ተርም ኩሎምብ ነቲ ናይ ምላሽ ሜዳን 1.1 ና.ሜ ዝኾነ ናይ ምቑራጽ ርሕቀትን ተጠቒምካ እዩ ዝሕሰብ። ቫንደር ዋልስ ዝብል ቃል 1.1 ና.ሜ ናይ ምቑራጽ ርሕቀት ዘለዎ ምቑራጽ ስኬም ዝጥቀም ኮይኑ፡ ቨርሌት ምቁራጽ ስኬም ድማ ንፖተሽናል ድሪፍት ይጥቀም (62)።
VMD ብምጥቃም ኣብ መንጎ DOPC phosphate beads ወይ ceramide AM1 beadsን እቲ ፕሮቲንን ዘሎ ቁርጽራጽ ማዕበል 0.7 nm ኮይኑ፡ ምስቲ ፕሮቲን ዝራኸቡ ብዝሒ ሽኮር ይሕሰብ። ብመሰረት እዚ ዝስዕብ ቀመር ከምቲ ኣብ (63) ዘሎ ናይ ምውዳቕ-ምህብታም (DE) ረቛሒ ኣስልጥ፦ DE ረቛሒ = (ብዝሒ ጠቕላላ ሽኮር ኣብቲ ፕሮቲን 0.7) ኣብ ፕሮቲን 0.7 (ብዝሒ Cer ኣብ ጠቕላላ ሽኮር)
እቲ ዝተጸብጸበ ዋጋ ከም ማእከላይ ደረጃ ዝረክብ ኮይኑ፡ እቶም ናይ ጌጋ ምልክታት ድማ ኣርባዕተ ነጻ ቅዳሓት ናይ SE እዮም። ስታቲስቲካዊ ትርጉም DE factor ብ t test [(averageDE-factor-1)/SE] ይሕሰብ። ካብቲ ሓደ ጭራ ዘለዎ ዝርገሐ P ዋጋ ኣስልጥ።
መሳርሒ GROMACS ኣብ ውሽጢ ናይ መወዳእታ 250 ns ናይቲ ትራስ ናይቲ Emp24 ዝሓዘ ስርዓት 2D lateral density map ንምሕሳብ ተጠቒሙ። ናይ ምህብታም/ምውዳእ ካርታ ሴራማይድ ንምርካብ፡ ካርታ ጽፍሒ Cer ብድምር ካርታ Cerን DOPCን ይምቀል፡ ድሕሪኡ ድማ ብውህደት Cer ኣብ ኣካላት ይምቀል። ተመሳሳሊ ሕብራዊ ካርታ ስኬል ይጥቀም።
ነዚ ጽሑፍ ዝኸውን ተወሳኺ ጽሑፋት ንምርካብ፡ በጃኹም http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ተወከሱ
እዚ ብመሰረት ውዕል ክሪኤቲቭ ኮመንስ ኣትሪብዩሽን-ዘይንግዳዊ ፍቓድ ዝተዘርግሐ ክፉት ተበጻሕነት ዘለዎ ጽሑፍ ኮይኑ፡ ኣብ ዝኾነ ማዕከን ዜና ምጥቃም፡ ምዝርጋሕን ምብዛሕን ዘፍቅድ ኮይኑ፡ እቲ ናይ መወዳእታ ኣጠቓቕማ ንንግዳዊ መኽሰብ ክሳብ ዘይኮነን እቲ መበገሲ ስራሕ ቅኑዕ ምዃኑን ክሳብ ዝኾነን እዩ። መጣቀሲ።
መተሓሳሰቢ፡ እቲ ናብቲ ገጽ ዝመኽርካዮ ሰብ ነቲ ኢመይል ክርእዮ ከም እትደልዮን ስፓም ከም ዘይኮነን ምእንቲ ክፈልጥ ጥራይ ኢና ኢመይልካ ክትህብ ንሓትት። ዝኾነ ናይ ኢመይል ኣድራሻ ኣይንሕዝን ኢና።
እዚ ሕቶ እዚ በጻሒ ምዃንካ ንምፍታንን ኣውቶማቲክ ስፓም ምቕራብ ንምክልኻልን ዝውዕል እዩ።
ሶፍያ ሮድሪገዝ-ጋላርዶ፡ ካዙኦ ኩሮካዋ፡ ሱዛና ሳቢዶ-ቦዞ፡ ኣሌሃንድሮ ኮርተዝ · ጎሜዝ (ኣሌሃንድሮ ኮርተስ-ጎሜዝ)፡ ኣትሱኮ ኢከዳ (ኣትሱኮ ኢከዳ)፡ ቫለርያ ዞኒ (ቫለርያ ዞኒ)፡ ኦክሲሊያዶራ ኣጉይለራ-ሮሜሮ፡ ኣና ማርያ ፔረዝ -ሊነሮ)፡ ሰርጅዮ ሎፔዝ (ሰርጅዮ ሎፔዝ)፡ ሚሆ ዋጋ (ሚሆ ዋጋ)፡ ሚሳኮ ኣርማን (ሚሳኮ ኣርማን)፡ ሚያኮ ሪማን (ሚያኮ ሪማን)፡ ፕሮው ኣኪራ፡ ስቴፋኖ ፋኒ፡ ኣኪሂኮ ናካኖ፡ ማኑኤል ሙኒዝ
3D ልዑል ርዝነት ዘለዎ ሓቀኛ ግዜ ምስሊ ኣብ ምሩጽ ውጽኢት ቦታታት ንፕሮቲን ምፍላይ ኣገዳስነት ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ የቃልዕ።
ሶፍያ ሮድሪገዝ-ጋላርዶ፡ ካዙኦ ኩሮካዋ፡ ሱዛና ሳቢዶ-ቦዞ፡ ኣሌሃንድሮ ኮርተዝ · ጎሜዝ (ኣሌሃንድሮ ኮርተስ-ጎሜዝ)፡ ኣትሱኮ ኢከዳ (ኣትሱኮ ኢከዳ)፡ ቫለርያ ዞኒ (ቫለርያ ዞኒ)፡ ኦክሲሊያዶራ ኣጉይለራ-ሮሜሮ፡ ኣና ማርያ ፔረዝ -ሊነሮ)፡ ሰርጅዮ ሎፔዝ (ሰርጅዮ ሎፔዝ)፡ ሚሆ ዋጋ (ሚሆ ዋጋ)፡ ሚሳኮ ኣርማን (ሚሳኮ ኣርማን)፡ ሚያኮ ሪማን (ሚያኮ ሪማን)፡ ፕሮው ኣኪራ፡ ስቴፋኖ ፋኒ፡ ኣኪሂኮ ናካኖ፡ ማኑኤል ሙኒዝ
3D ልዑል ርዝነት ዘለዎ ሓቀኛ ግዜ ምስሊ ኣብ ምሩጽ ውጽኢት ቦታታት ንፕሮቲን ምፍላይ ኣገዳስነት ንውሓት ሰንሰለት ሴራማይድ የቃልዕ።
©2020 ማሕበር ምዕባለ ሳይንስ ኣሜሪካ። ኩሉ መሰላት ዝተሓለወ እዩ። AAAS መሻርኽቲ ናይ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ከምኡ ውን COUNTER እዩ። ሳይንስኣድቫንስ ISSN 2375-2548።