ኣቐዲምና ኣብቶም ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘለዎም ሕሙማት፡ ደረጃ ሴረም ናይቲ ካብ መዓንጣ ዝመጽእ ትሪፕቶፋን መተቦላይት ኢንዶል-3-ፕሮፒዮኒክ ኣሲድ (IPA) ትሑት ምዃኑ ጸብጺብና ነይርና። ኣብዚ መጽናዕቲ፡ ኣብ ስብሕቲ ጸላም ከብዲ ዝርከብ ትራንስክሪፕቶምን ዲኤንኤ ሜቲሎምን ምስ ደረጃ ሴረም IPA ብዝተኣሳሰር፡ ከምኡ’ውን ተራ IPA ኣብ ምልዕዓል ፊኖታይፒክ ዘይምንቅስቓስ ዋህዮታት ስቴሌት ጸላም ከብዲ (HSCs) ኣብ ቪትሮ መርሚርናዮ።
እቲ መጽናዕቲ፡ 116 ስብሒ ዘለዎም ሕሙማት ዓይነት 2 ሕማም ሽኮር ሜሊተስ (T2DM) (ዕድመ 46.8 ± 9.3 ዓመት፤ BMI: 42.7 ± 5.0 ኪሎ/ሜ2) ዘጠቓለለ ኮይኑ፡ ኣብ ማእከል መጥባሕቲ ምጉዳል ምጉዳል ስብሒ ኩኦፒዮ (KOBS) መጥባሕቲ ምጉዳል ተገይሩሎም። ኣብ ዙረት ዘሎ ደረጃታት IPA ብፈሳሲ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ተለኪዑ፣ ትንተና ትራንስክሪፕቶም ጸላም ከብዲ ብጠቕላላ RNA መስርዕ፣ ከምኡ’ውን ትንተና DNA methylation Infinium HumanMethylation450 BeadChip ተጠቒምካ ተኻይዱ። ንናይ ሰብ ጸላም ከብዲ ስቴሌት ዋህዮታት (LX-2) ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro experiments) ተጠቒሞም።
ደረጃታት ሴረም IPA ምስ መግለጺ ናይቶም ኣብ ኣፖፕቶቲክ፣ ማይቶፋጂክን ነዊሕ ዕድመ መንገድታት ኣብ ጸላም ከብዲ ዝሳተፉ ጂናት ዝተኣሳሰር እዩ። AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) ጂን ኣብ ትራንስክሪፕት ጸላም ከብድን ዲኤንኤ ሜቲለሽንን ፕሮፋይላት እቲ ዝበዝሐን ዓብላሊን መስተጋብራዊ ጂን እዩ ነይሩ። ሕክምና IPA ንኣፖፕቶሲስ ኣለዓዒሉ፣ ምትንፋስ ማይቶኮንድርያል ኣጉዲሉ፣ ንሞርፎሎጂ ዋህዮታትን ዳይናሚክስ ማይቶኮንድርያልን ብምቕያር ንመግለጺ ናይቶም ንፋይብሮሲስ፣ ኣፖፕቶሲስን ብህይወት ምንባር ዋህዮታት LX-2ን ዝቆጻጸሩ ዝፍለጡ ጂናት ብምምሕያሽ ኣካይዱ።
እዞም መረዳእታታት ብሓባር እንተተራእዮም፡ IPA ተኽእሎታት ፍወሳዊ ውጽኢት ከም ዘለዎን ንኣፖፕቶሲስ ከለዓዕልን ንኤችኤስሲ ፊኖታይፕ ናብ ዘይንጡፍ ኩነታት ከሰጋግርን ከም ዝኽእልን ይድግፉ፡ በዚ ድማ ኣብ ምንቅስቓስ ኤችኤስሲን ምትሕልላፍ ማይቶኮንድርያልን ብምትእትታው ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ናይ ምዕጋት ተኽእሎ የስፍሕ።
ዝርገሐ ስብሕን ምትሕውዋስ መግቢን ምስ ምውሳኽ ተርእዮ ምስ ምትሕውዋስ መግቢ ዝተኣሳሰር ስብሒ ጸላም ከብዲ (MASLD) ዝተኣሳሰር ምዃኑ ተረጋጊጹ፤ እቲ ሕማም ካብ 25% ክሳብ 30% ሓፈሻዊ ህዝቢ የጥቅዕ [1] ። ቀንዲ ሳዕቤን ናይ MASLD ምኽንያት ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ኮይኑ፡ ብቐጻሊ ምውህላል ፋይብሮስ ውጽእ ዋህዮ ማትሪክስ (ECM) ዝልለ ዳይናሚክ መስርሕ እዩ [2]። ኣብ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዝሳተፉ ቀንዲ ዋህዮታት ዋህዮታት ስቴሌት ጸላም ከብዲ (HSCs) ኮይኖም፡ ኣርባዕተ ፍሉጣት ፊኖታይፕታት ዘርእዩ ኮይኖም፡ ስቕ ዝብሉ፡ ንጡፋት፡ ዘይንጡፋትን ዝኣረጉን እዮም [3, 4]። HSCs ካብ ስቕ ዝበለ ቅርጺ ናብ ልዑል ጠለብ ጸዓት ዘለዎም ምብዛሕ ፋይብሮብላስት ዝመስሉ ዋህዮታት ክነጥፉን ክፈላለዩን ይኽእሉ፣ ምስ ምውሳኽ መግለጺ α-ልሙጽ ጭዋዳ ኣክቲን (α-SMA)ን ዓይነት I ኮላጀንን (Col-I) [5, 6]። ኣብ እዋን ምግልባጥ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ፡ ንጡፋት HSCs ብመንገዲ ኣፖፕቶሲስ ወይ ዘይምንቅስቓስ ይውገዱ። እዞም መስርሓት ዳውንረጉለሽን ናይ ፋይብሮጀኒክ ጂናትን ምምሕያሽ ናይ ፕሮሰርቫይቫል ጂናት (ከም NF-κBን PI3K/Akt signaling pathwaysን) [7, 8]፣ ከምኡ’ውን ለውጢ ኣብ ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስን ተግባርን [9] የጠቓልሉ።
ኣብ መዓንጣ ዝፍጠር ትሪፕቶፋን መተቦላይት ኢንዶል-3-ፕሮፒዮኒክ ኣሲድ (IPA) ኣብ ሴረም ኣብ MASLD ሓዊሱ ኣብ ናይ ሰብ መተቦሊክ ሕማማት ከም ዝንኪ ተረጋጊጹ ኣሎ [10–13]። IPA ምስ ኣመጋግባ ፋይበር ዝተኣሳሰር ኮይኑ፡ ብጸረ-ኦክስጅንን ጸረ-ነድሪን ጽልዋታቱ ይፍለጥ፡ ከምኡ’ውን ነቲ ብመግቢ ዝመጽእ ዘይ-ኣልኮላዊ ስቲቶሄፓታይተስ (NASH) ፊኖታይፕ ኣብ vivoን in vitroን የዳኽሞ [11–14]። ገለ መርትዖታት ካብቲ ዝሓለፈ መጽናዕትና ዝመጽእ ኮይኑ፡ ኣብ መጽናዕቲ መጥባሕቲ ባርያትሪክ ኩኦፒዮ (KOBS) ካብቶም ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘለዎም ሕሙማት ካብቶም ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘይብሎም ስብሒ ዘለዎም ሕሙማት፡ ደረጃ ሴረም IPA ትሑት ምዃኑ ኣረጋጊጹ። ካብዚ ብተወሳኺ፡ ሕክምና IPA ኣብ ሞዴል ናይ ሰብ ጸላም ከብዲ ስቴሌት ዋህዮ (LX-2) ናይ ዋህዮ ምትሕንፋጽ፡ ዋህዮ ስደትን ሄማቶፖየቲክ ስቴም ሴል ምንቅስቓስን ክላሲካዊ ምልክታት ዝኾኑ ጂናት መግለጺ ከጉድል ከም ዝኽእልን ንጸላም ከብዲ ዝከላኸል መተቦላይት ክኸውን ከም ዝኽእልን ኣርእይና [15]። ይኹን እምበር፡ IPA ከመይ ጌሩ ንHSC apoptosisን mitochondrial bioenergeticsን ብምንቅስቓስ ንናይ ጸላም ከብዲ ፋይብሮሲስ ሪግረሽን ከም ዝድርኽ ንጹር ኣይኮነን።
ኣብዚ፡ ሴረም IPA ምስ መግለጺ ብኣፖፕቶሲስ፡ ማይቶፋጂን መንገድታት ነዊሕ ዕድመን ዝሃብተሙ ጂናት ኣብ ጸላም ከብዲ ስብሒ ዘለዎም ግን ከኣ ዓይነት 2 ሽኮርያ ዘይኮኑ (KOBS) ውልቀሰባት ዝተኣሳሰር ምዃኑ ነርኢ። ካብዚ ሓሊፉ፡ IPA ብመንገዲ መንገዲ ዘይምንቅስቓስ ኣቢሉ ንጽሬትን ምብስባስን ኣክቲቬትድ ሄማቶፖየቲክ ስቴም ሴልስ (HSCs) ክድርኽ ከምዝኽእል ረኺብናዮ። እዞም ውጽኢታት ንIPA ልብወለዳዊ ተራ ከምዘለዎ ዘቃልዑ ኮይኖም፡ ንሊቨር ፋይብሮሲስ ሪግረሽን ንምድንፋዕ ክኸውን ዝኽእል ፍወሳዊ ዕላማ ይገብሮ።
ቅድሚ ሕጂ ኣብ KOBS cohort ዝተገብረ መጽናዕቲ ከም ዘመልክቶ፡ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘለዎም ሕሙማት ምስቶም ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘይብሎም ሕሙማት ክነጻጸሩ እንከለዉ፡ ትሑት ደረጃ ዑደት IPA ከም ዘለዎም ይሕብር [15]። ነቲ ክህሉ ዝኽእል ምድንጋር ውጽኢት ዓይነት 2 ሕማም ሽኮር ንምግላል፡ ካብቲ ዝቕጽል ዘሎ መጽናዕቲ KOBS ከም ህዝቢ መጽናዕቲ 116 ዓይነት 2 ሕማም ሽኮር ዘይብሎም ስብሒ ዘለዎም ሕሙማት (ማእከላይ ዕድመ ± SD: 46.8 ± 9.3 ዓመት፤ BMI: 42.7 ± 5.0 ኪሎ/ሜ2) (ሰንጠረዥ 1) መልሚልናዮም [16]። ኩሎም ተሳተፍቲ ብጽሑፍ ብሓበሬታ ዝተሰነየ ፍቓድ ሂቦም፡ እቲ መጽናዕታዊ ፕሮቶኮል ድማ ብመሰረት ኣዋጅ ሄልሲንኪ (54/2005፡ 104/2008ን 27/2010ን) ብኮሚተ ስነ-ምግባር ሆስፒታል ኖርዝ ሳቮ ካውንቲ ተቐባልነት ረኺቡ።
ናይ ጸላም ከብዲ ባዮፕሲ መርመራታት ኣብ እዋን ባርያትሪክ መጥባሕቲ ተረኺቡን ብመሰረት ኣቐዲሙ ዝተገልጸ መዐቀኒታት ብተመኩሮ ክኢላታት ፓቶሎጂ ብሂስትሎጂ ተገምጊሙ [17, 18]። እቶም ናይ ገምጋም መዐቀኒታት ኣብ ተወሳኺ ሰሌዳ S1 ተጠቓሊሎም ዘለዉ ኮይኖም ቅድሚ ሕጂ ተገሊጾም እዮም [19]።
ናይ ጾም ሴረም ናሙናታት ብዘይተዓለመ ፈሳሲ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ንሜታቦሎሚክስ ትንተና (n = 116) ተተንቲኑ። ናሙናታት ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ UHPLC-qTOF-MS ስርዓት (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) ተጠቒሞም ተተንቲኖም እዮም19። ምልላይ ኣይሶፕሮፒል ኣልኮል (IPA) ኣብ ናይ ምዕቃብ ግዜን ምውድዳር MS/MS ስፔክትረም ምስ ጽሩይ ደረጃታትን ዝተመርኮሰ እዩ ነይሩ። ኣብ ኩሎም ተወሳኺ ትንተናታት ጽዓት ምልክት IPA (peak area) ኣብ ግምት ኣትዩ [20]።
ምሉእ ጸላም ከብዲ RNA መስርዕ Illumina HiSeq 2500 ተጠቒምካ ዝተኻየደ ኮይኑ ዳታ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ቅድመ መስርሕ ተገይሩሉ [19, 21, 22]። ካብ MitoMiner 4.0 ዳታቤዝ ዝተመርጹ 1957 ጂናት ተጠቒምና ዕላማ ዝገበረ ፍልልያዊ መግለጺ ትንተና ናይ ማይቶኮንድርያል ተግባር/ባዮጀነሲስ ዝጸሉ ትራንስክሪፕት ኣካይድና። ትንተና ዲኤንኤ ሜቲለሽን ጸላም ከብዲ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ኣገባብ ተጠቒምካ Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ [24, 25]።
ናይ ሰብ ጸላም ከብዲ ስቴሌት ዋህዮታት (LX-2) ብሕያውነት ብፕሮፌሰር ስቴፋኖ ሮሜዮ ተዋሂቦም ኣብ DMEM/F12 ማእከላይ (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) ተባሂሎምን ተዓቂቦምን እዮም። ናይ ስራሕ መጠን IPA ንምምራጽ፡ ዋህዮታት LX-2 ብዝተፈላለየ ትሕዝቶ IPA (10 μM, 100 μM and 1 mM; Sigma, 220027) ኣብ DMEM/F12 medium ን24 ሰዓታት ተሓኪሞም። ካብዚ ብተወሳኺ IPA ንHSCs ናይ ዘይምንቅስቓስ ዓቕሚ ንምምርማር LX-2 ዋህዮታት ምስ 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF)ን 1 mM IPAን ኣብ ሴረም-ነፃ ማእኸላይ ን24 ሰዓታት ብሓባር ተሓኪሞም። ነቶም ተዛመድቲ ተሽከርከርቲ ቁጽጽር፡ 0.1% BSA ዝሓዘ 4 nM HCL ንሕክምና TGF-β1፡ 0.05% DMSO ድማ ንሕክምና IPA ተጠቒሙ፡ ክልቲኦም ድማ ብሓባር ንውህደት ሕክምና ተጠቒሞም።
ኣፖፕቶሲስ ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ምስ 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ተጠቒምካ እዩ ተገምጊሙ። ብሓጺሩ፡ LX-2 (1 × 105 ዋህዮታት/ጉድጓድ) ኣብ 12-ጉድጓድ ጽላት ንሓደ ለይቲ ተባሂሎም፡ ድሕሪኡ ብብዙሕ መጠን IPA ወይ IPAን TGF-β1ን ተሓኪሞም። ንጽባሒቱ ዝንሳፈፉን ተጣበቕትን ዋህዮታት ተኣኪቦም፡ ትሪፕሲን ተገይሮም፡ ብፒቢኤስ ተሓጺቦም፡ ኣብ ኣነክሲን V መእሰሪ መከላኸሊ ዳግማይ ተዓጽዮም፡ ምስ FITC-Annexin Vን 7-AADን ን15 ደቓይቕ ተሓቢኦም።
ኣብ ህያዋን ዋህዮታት ዝርከቡ ማይቶኮንድርያ ንኦክሲዳቲቭ ንጥፈታት ብሚቶትራከርTM ሬድ ሲኤምኤክስሮስ (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ተጠቒሞም ተለኺዮም እዮም። ንMTR መርመራታት፡ ዋህዮታት LX-2 ብማዕረ ጽፍሒ ምስ IPAን TGF-β1ን ተሓቢኦም እዮም። ድሕሪ 24 ሰዓት፡ ህያዋን ዋህዮታት ትሪፕሲናይዝድ ተገይሮም፡ ብፒቢኤስ ተሓጺቦም፡ ድሕሪኡ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ብ100 μM MTR ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን20 ደቓይቕ ተሓቢኦም [ 26 ]። ንትንተና ሞርፎሎጂ ህያው ዋህዮታት፡ ዓቐን ዋህዮታትን ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነትን ብቕደም ተኸተል ንቕድሚት ፋሕፋሕ (FSC)ን ጎድናዊ ፋሕፋሕ (SSC)ን መለክዒታት ተጠቒሞም ተተንቲኖም።
ኩሉ ዳታ (30,000 ፍጻመታት) NovoCyte Quanteon (Agilent) ተጠቒምካ ዝተረኽበ ኮይኑ፡ NovoExpress® 1.4.1 ወይ FlowJo V.10 ሶፍትዌር ተጠቒምካ ዝተተንተነ እዩ።
ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ ብሲሆርስ ኤክስኤፍ ሴል ማይቶ ስትረስ ዝተዓጠቐ ሲሆርስ ኤክስትራሴሉላር ፍሉክስ ኣናላይዘር (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ኣብ ሓቀኛ ግዜ ተለኪዑ። ብሓፂሩ 2 × 104 LX-2 ዋህዮታት/ጉድጓድ ኣብ XF96 ዋህዮ ባህሊ ፅላት ተዘሪኦም እዮም። ድሕሪ ንሓደ ለይቲ ምሕቃቕ፡ ዋህዮታት ብኣይሶፕሮፓኖል (IPA)ን TGF-β1ን (ተመላላኢ ሜላታት 1) ተሓኪሞም። ትንተና መረዳእታ ሲሆርስ ኤክስኤፍ ዌቭ ሶፍትዌር ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ፣ እዚ ሶፍትዌር ሲሆርስ ኤክስኤፍ ሴል ኢነርጂ ፊኖታይፕ ቴስት ሪፖርት ጀነሬተር ዘጠቓለለ እዩ። ካብዚ ድማ ባዮኢነርጂቲክ ሄልዝ ኢንዴክስ (BHI) ተሓሲቡ [27]።
ጠቕላላ RNA ናብ cDNA ተጻሒፉ። ንፍሉይ ኣገባባት መወከሲ [15] ርአ። ደረጃታት ናይ ሰብ 60S ራይቦሶማል ኣሲዳዊ ፕሮቲን P0 (RPLP0)ን ሳይክሎፊሊን A1 (PPIA)ን mRNA ከም ቅዋማዊ ጂን ቁጽጽር ተጠቒሞም። QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) ምስ TaqManTM Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ወይ Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) ተጠቒሙ፣ ኣንጻራዊ ጂን መግለጺ ዕጽፊ ድማ ንጽጽራዊ Ct ዋጋ ዑደት መለክዒታት (ΔΔCt)ን እቲ... ∆∆Ct ኣገባብ። ዝርዝር ናይቶም ፕራይመራት ኣብ ተወሳኺ ሰሌዳታት S2ን S3ን ተዋሂቡ ኣሎ።
ኒዩክለር ዲኤንኤ (ncDNA)ን ማይቶኮንድርያል ዲኤንኤን (mtDNA) ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) ተጠቒምካ ተቐዲሑ [28]። ተዛማዲ መጠን mtDNA ከምቲ ኣብ ተወሳኺ ሜላታት 2 ብዝርዝር ተገሊጹ ዘሎ፡ ሬሽዮ ነፍሲ ወከፍ ዕላማ ዝኾነ ዞባ mtDNA ምስ ጂኦሜትሪካዊ ማእከላይ ደረጃ ናይቶም ሰለስተ ኒዩክለራዊ ዲኤንኤ ዞባታት (mtDNA/ncDNA) ብምሕሳብ እዩ ተሰሊዑ።ዝርዝር ናይቶም ንmtDNAን ncDNAን ዝኸውን ፕራይመራት ኣብ ተወሳኺ ሰሌዳ S4 ተዋሂቡ ኣሎ።
ህያዋን ዋህዮታት ብMitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ተለኺዮም ኣብ መንጎ ዋህዮታትን ውሽጣዊ ዋህዮታትን ማይቶኮንድርያል መርበባት ንምርኣይ ተገይሩ። LX-2 ዋህዮታት (1 × 104 ዋህዮታት/ጉድጓድ) ኣብ ብርጭቆ ስላይድ ኣብ ተዛመድቲ ብርጭቆ-ታሕተዋይ ባህሊ ጽላት (Ibidi GmbH, Martinsried, ጀርመን) ባህሊ. ድሕሪ 24 ሰዓት ህያዋን LX-2 ዋህዮታት ብ100 μM MTR ን20 ደቓይቕ ኣብ 37 °C ተሓቢኦም ኒውክለስ ዋህዮታት ድማ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ብDAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ተለኺዮም [29]። ማይቶኮንድርያል መርበባት ብዘይስ ኣክሲዮ ኦብዘርቨር ዝተገልበጠ ማይክሮስኮፕ (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ብዘይስ ኤልኤስኤም 800 ኮንፎካል ሞዱል ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ኣብ ርጥብ ዝበለ ሃዋህው ምስ 5% CO2 63×NA 1.3 ዕላማ ተጠቒምካ ብስእሊ ተራእዮም። ንነፍሲ ወከፍ ዓይነት ናሙና ዓሰርተ Z-series ምስልታት ኣጥሪና። ነፍሲ ወከፍ Z-series 30 ክፍልታት ዝሓዘ ኮይኑ፡ ነፍሲ ወከፎም 9.86 μm ርጉድና ኣለዎም። ንነፍሲ ወከፍ ናሙና፡ ምስልታት ዓሰርተ ዝተፈላለዩ ዓውድታት ርእይቶ ZEN 2009 ሶፍትዌር (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ተጠቒምካ ዝተረኸበ ኮይኑ፡ ትንተና ሞርፎሎጂ ማይቶኮንድርያል ድማ ImageJ ሶፍትዌር (v1.54d) [30, 31] ብመሰረት ኣብ ተወሳኺ ሜላታት 3 ብዝርዝር ዝተገልጸ መለክዒታት ተኻይዱ።
እቶም ዋህዮታት ብ2% ግሉታራልደሃይድ ኣብ 0.1 M ፎስፌት መከላኸሊ ተቐሚጦም፣ ድሕሪኡ ብ1% ኦስሚየም ቴትሮክሳይድ ፍታሕ (ሲግማ ኣልድሪች፣ MO, USA) ተጸኒዖም፣ በብቑሩብ ብኣሲቶን (Merck, Darmstadt, Germany) ማይ ተሓጺቦም፣ ኣብ መወዳእታ ድማ ኣብ ኢፖክሲ ረዚን ተሰዂዖም። ኣዝዮም ቀጠንቲ ክፍልታት ተዳልዮም ብ1% ዩራኒል ኣሴቴት (መርክ፣ ዳርምስታድ፣ ጀርመን)ን 1% ሊድ ሲትሬትን (መርክ፣ ዳርምስታድ፣ ጀርመን) ተለኺዮም። ኣልትራስትራክቸራል ምስልታት ብJEM 2100F EXII ትራንስሚሽን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ኣብ ምቅልጣፍ ቮልቴጅ 80 ኪሎ ቮልት ተጠቒምካ ዝተረኸበ እዩ።
ሞርፎሎጂ ናይ LX-2 ዋህዮታት ብIPA ን24 ሰዓታት ዝተሓከሙ ብፌዝ-ኮንትራስት ማይክሮስኮፒ ኣብ 50x ማግኒፊኬሽን Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 and AxioCam MRm, Jena, Germany) ተጠቒምካ ተተንቲኑ።
ክሊኒካዊ መረዳእታ ብማእከላይ ± መደበኛ ምዝንባል ወይ ማእከላይ (interquartile range: IQR) ተገሊጹ። ኣብ መንጎ እቶም ሰለስተ ጉጅለታት መጽናዕቲ ፍልልያት ንምንጽጻር፡ ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ (ቀጻሊ ተቐያየርቲ) ወይ χ2 ፈተና (ምድባዊ ተለዋዋጢ) ተጠቒሞም። እቲ ናይ ሓሶት ኣወንታዊ ደረጃ (FDR) ንብዙሕ መርመራታት ንምእራም ተጠቒሙ፡ FDR < 0.05 ዘለዎም ጂናት ድማ ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎም ተባሂሎም ተቖጺሮም። ስፒርማን ምትእስሳር ትንተና CpG DNA methylation ምስ IPA ምልክት ጽዓት ንምትእስሳር ተጠቒሙ፣ ስማዊ p ክብርታት (p < 0.05) ተጸብጺቡ።
ትንተና መንገዲ ን268 ትራንስክሪፕት (ስማዊ p < 0.01)፣ 119 ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰሩ ትራንስክሪፕት (ስማዊ p < 0.05)፣ ከምኡ እውን 4350 CpGs ካብ 3093 ትራንስክሪፕት ጸላም ከብዲ ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰሩ ኣብ መርበብ ሓበሬታ ዝተመርኮሰ መሳርሒ ትንተና ጂን (WebGestalt) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። እቲ ብናጻ ዝረኽቦ መሳርሒ ቬኒ ዲቢ (ስሪት 2.1.0) ዝተደራረቡ ጂናት ንምርካብ፡ StringDB (ስሪት 11.5) ድማ ንፕሮቲን-ፕሮቲን ምትእስሳር ንምስኣል ተጠቒሙ።
ንፈተነ LX-2፡ ናሙናታት ንቡር ምዃኖም ብ D'Agostino-Pearson test ተጠቒሞም ተፈቲኖም። መረዳእታ ብውሑዱ ካብ ሰለስተ ባዮሎጂካዊ ተደጋጋሚ ተረኺቡ ብሓደ-ኣንፈት ANOVA ምስ ቦንፈሮኒ ድሕረ-ግዜ ፈተና ተገይሩሉ። ትሕቲ 0.05 ዝኾነ p-value ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎ ተባሂሉ ተቖጺሩ። መረዳእታታት ብማእኸላይ ± SD ይቐርቡ፣ ብዝሒ ፈተነታት ድማ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ስእሊ ተጠቒሱ ኣሎ። ኩሎም ትንተናታትን ግራፋትን ንዊንዶውስ ዝኸውን ግራፍፓድ ፕሪዝም 8 ስታቲስቲካዊ ሶፍትዌር (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, USA) ተጠቒሞም እዮም ተኻይዶም።
ፈለማ፡ ደረጃታት ሴረም ኣይፒኤ ምስ ትራንስክሪፕት ጸላም ከብዲ፡ ምሉእ ኣካላትን ማይቶኮንድርያልን ዘለዎ ምትእስሳር መርሚርናዮ። ኣብ ጠቕላላ ትራንስክሪፕት ፕሮፋይል፡ ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰር ዝሓየለ ጂን MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3) እዩ ነይሩ፤ ኣብቲ ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰር ትራንስክሪፕት ፕሮፋይል፡ እቲ ዝሓየለ ተዛማዲ ጂን AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (ተወሳኺ ፋይል 1ን ተወሳኺ ፋይል 2ን) እዩ ነይሩ።
ብድሕሪኡ ዓለማዊ ትራንስክሪፕት (n = 268; p < 0.01) ከምኡ’ውን ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰሩ ትራንስክሪፕት (n = 119; p < 0.05) ተንቲንና፣ ኣብ መወዳእታ ኣፖፕቶሲስ ከም እቲ ዝዓበየ ትርጉም ዘለዎ ቀኖናዊ መንገዲ (p = 0.0089) ኣለሊናዮ። ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰሩ ማይቶኮንድርያል ትራንስክሪፕትስ፡ ኣብ ኣፖፕቶሲስ (FDR = 0.00001)፡ ማይቶፋጂ (FDR = 0.00029)፡ ከምኡ’ውን TNF ምልክት መንገድታት (FDR = 0.000006) ኣተኲርና ኢና (ስእሊ 1A፡ ሰሌዳ 2፡ ከምኡ’ውን ተወሳኺ ስእልታት 1A-B)።
ተደራራቢ ትንተና ዓለማዊ፡ ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰሩ ትራንስክሪፕት፡ ከምኡ’ውን ዲኤንኤ ሜቲለሽን ኣብ ጸላም ከብዲ ሰብ ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰር። A ን268 ዓለማዊ ትራንስክሪፕት፣ 119 ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰሩ ትራንስክሪፕት፣ ከምኡ እውን ምስ ዲኤንኤ ሜቲለይትድ ትራንስክሪፕት ዝውክል ኮይኑ ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰሩ 3092 CpG ቦታታት (p values ​​< 0.01 ንዓለምለኻዊ ትራንስክሪፕትስን DNA methylatedን፣ ከምኡውን p values ​​< 0.05 ንማይቶኮንድርያ ትራንስክሪፕት) ዝተኣሳሰሩ እዮም። እቶም ዓበይቲ ተደራራቢ ትራንስክሪፕት ኣብ ማእከል (AKT1 and YKT6) ተገሊጾም ኣለዉ። B ናይቶም ዝለዓለ ናይ ምትእስሳር ነጥቢ (0.900) ዘለዎም 13 ጂናት ምስ ካልኦት ጂናት ናይ ምትእስሳር ካርታ ካብቶም ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ብዓቢኡ ዝተኣሳሰሩ 56 ተደራራቢ ጂናት (ዞባ ጸሊም መስመር) ብኦንላይን መሳርሒ StringDB ተጠቒምካ ዝተሃንጸ እዩ። ቀጠልያ: ጂናት ናብ ጂን ኦንቶሎጂ (GO) ዋህዮኣዊ ባእታ: ማይቶኮንድርያ (GO:0005739) ኣብ ካርታ ዝተቐመጡ። AKT1 ኣብቲ ዳታ (ኣብ ጽሑፍ ዕደና፣ ፈተነታት፣ ዳታቤዛትን ሓባራዊ መግለጺን ዝተመርኮሰ) ምስ ካልኦት ፕሮቲናት ንዝግበር ርክብ ዝለዓለ ነጥቢ (0.900) ዝረኸበ ፕሮቲን እዩ። መርበብ ኖድስ ንፕሮቲናት ክውክሉ እንከለዉ፡ ወሰናት ድማ ኣብ መንጎ ፕሮቲናት ዘሎ ምትእስሳር ይውክሉ።
ናይ መዓንጣ ማይክሮባዮታ መተቦላይት ብዲኤንኤ ሜቲለሽን [32] ኣቢሎም ንኤፒጀነቲክ ውህደት ክቆጻጸሩ ስለዝኽእሉ፡ ደረጃታት ሴረም IPA ምስ ናይ ጸላም ከብዲ ዲኤንኤ ሜቲለሽን ዝተኣሳሰር ድዩ ኣይኮነን መርሚርናዮ። ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰሩ ክልተ ዓበይቲ ናይ ሜቲለሽን ቦታታት ኣብ ጥቓ ፕሮሊን-ሰሪን ዝሃብተመ ዞባ 3 (C19orf55)ን ዋዒ ስንባደ ፕሮቲን ስድራቤት B (ንእሽቶ) ኣባል 6 (HSPB6)ን (ተወሳኺ ፋይል 3) ምዃኖም ረኺብናዮ። ዲኤንኤ ሜቲለሽን 4350 CpG (p < 0.01) ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ዝተኣሳሰር ኮይኑ ብነዊሕ ዕድመ ምቁጽጻር መንገድታት (p = 0.006) ሃብታም እዩ ነይሩ (ስእሊ 1A, ሰሌዳ 2, ከምኡውን ተወሳኺ ስእሊ 1C)።
ኣብ መንጎ ደረጃታት ሴረም IPA፡ ዓለማዊ ትራንስክሪፕት፡ ምስ ማይቶኮንድርያ ዝተኣሳሰሩ ትራንስክሪፕት፡ ከምኡ’ውን ዲኤንኤ ሜቲለሽን ኣብ ጸላም ከብዲ ሰብ ዘሎ ምትእስሳር መሰረት ዝኾኑ ስነ-ህይወታዊ ኣገባባት ንምርዳእ፡ ኣብ ዝሓለፈ ትንተና መንገዲ ዝተለለዩ ጂናት ናይ ምድብላቕ ትንተና ኣካይድና (ስእሊ 1A)። ውጽኢት ትንተና ምህብታም መንገዲ ናይቶም 56 ተደራራቢ ጂናት (ኣብ ውሽጢ ጸሊም መስመር ኣብ ስእሊ 1A) ከም ዘርእዮ፡ እቲ ኣፖፕቶሲስ መንገዲ (p = 0.00029) ኣብቶም ሰለስተ ትንተናታት ልሙዳት ክልተ ጂናት ከም ዘጉልሐ ኣርእዩ፡ AKT1ን YKT6ን (YKT6 v-SNARE homolog)፡ ከምቲ ኣብ ቬን ስእላዊ ስእሊ (ተመላላኢ ስእሊ 2ን ስእሊ 1Aን) ተገሊጹ። እቲ ዝገርም፡ AKT1 (cg19831386)ን YKT6 (cg24161647)ን ምስ ደረጃታት ሴረም IPA ብኣወንታ ዝተኣሳሰሩ ምዃኖም ረኺብናዮ (ተወሳኺ ፋይል 3)። ኣብ መንጎ ፍርያት ጂን ክህሉ ዝኽእል ናይ ፕሮቲን ምትእስሳር ንምልላይ፡ ካብ 56 ተደራራቢ ጂናት ዝለዓለ ናይ ሓባር ዞባ ነጥቢ (0.900) ዘለዎም 13 ጂናት ከም እታው መሪጽና፡ ናይ ምትእስሳር ካርታ ሰሪሕና። ብመሰረት ደረጃ ምትእምማን (marginal confidence) ዝለዓለ ነጥቢ (0.900) ዝረኸበ AKT1 ጂን ኣብ ላዕሊ እዩ ነይሩ (ስእሊ 1B)።
ኣብ ትንተና መንገዲ ብምብጋስ፡ ኣፖፕቶሲስ እቲ ቀንዲ መንገዲ ምዃኑ ረኺብናዮ፡ ስለዚ ሕክምና IPA ንኣፖፕቶሲስ HSCs ኣብ ቪትሮ ክጸልዎ ድዩ ኣይጸልዎን መርሚርናዮ። ቅድሚ ሕጂ ዝተፈላለየ መጠን IPA (10 μM, 100 μM, and 1 mM) ንLX-2 ዋህዮታት መርዛም ከምዘይኮነ ኣርእይና ኢና [15]። እዚ መፅናዕቲ ከም ዘመልክቶ ኣብ 10 μMን 100 μMን IPA ምሕካም ቁፅሪ ህያዋንን ኔክሮቲክን ዋህዮታት ከም ዝውስኽ ኣረጋጊፁ። ይኹን እምበር ምስቲ ቁፅፅር ጉጅለ እንትነፃፀር ኣብ 1 ሚሊ ሜትር IPA ምትእኽኻብ ህላወ ዋህዮታት ክጎድል እንከሎ፣ ደረጃ ኔክሮሲስ ዋህዮታት ግን ከምዘይተቐየረ እዩ ዝፀንሐ (ስእሊ 2A, B)። ቀጺልና፡ ኣብ LX-2 ዋህዮታት ኣፖፕቶሲስ ንምልዕዓል ምቹእ ምትእኽኻብ ንምርካብ፡ 10 μM, 100 μM, ከምኡ’ውን 1 mM IPA ን24 ሰዓት ፈቲንናዮ (ስእሊ 2A-Eን ተወሳኺ ስእሊ 3A-Bን)። እቲ ዝገርም፡ IPA 10 μMን 100 μMን ንመጠን ኣፖፕቶሲስ (%) ኣጉዲሉዎ፡ ይኹን እምበር፡ IPA 1 mM ምስ ቁጽጽር ክነጻጸር እንከሎ፡ ደንጉዩ ዝመጽእ ኣፖፕቶሲስን ደረጃ ኣፖፕቶሲስን (%) ኣዕብዩ፡ ስለዚ ንተወሳኺ ፈተነታት ተመሪጹ (ስእልታት 2A–D)።
IPA ናይ LX-2 ዋህዮታት ኣፖፕቶሲስ ይድርኽ። ንኣፖፕቶቲክ ሬትን ሞርፎሎጂ ዋህዮን ብፍሎው ሳይቶሜትሪ ንምቑፃር ኣነክሲን Vን 7-AADን ድርብ ምልካይ ሜላ ተጠቒምና ኢና። ዋህዮታት BA ምስ 10 μM, 100 μMን 1 mM IPAን ን24 ሰዓታት ወይ ድማ ምስ F–H TGF-β1 (5 ng/ml)ን 1 mM IPAን ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ን24 ሰዓታት ተሓቢኦም እዮም። መልሲ፡ ህያዋን ዋህዮታት (ኣነክሲን V -/ 7AAD-)፤ B: ኔክሮቲክ ዋህዮታት (ኣነክሲን V -/ 7AAD+)፤ C, F: ብኣግኡ (ኣነክሲን V +/ 7AAD-)፤ D, G: ደንጉዩ (ኣነክሲን V+/7AAD.+)፤ E, H: ሚእታዊት ናይ ጠቕላላ ቅድመን ዳሕረዋይን ኣፖፕቶቲክ ዋህዮታት ኣብ ኣፖፕቶቲክ ሬት (%)። ዳታ ብማእከላይ ± SD, n = 3 ነጻ ፈተነታት ይግለጽ። ስታቲስቲካዊ ንጽጽር ብሓደ-ኣንፈት ANOVA ምስ Bonferroni post hoc test ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። *p < 0.05፤ ****p < 0.0001 እዩ።
ከምቲ ኣቐዲምና ዘርኣናዮ 5 ng/ml TGF-β1 መግለጺ ክላሲካል ማርከር ጂናት ብምውሳኽ HSC activation ክድርኽ ይኽእል [15]። LX-2 ዋህዮታት ብ5 ng/ml TGF-β1ን 1 mM IPAን ብሓባር ተሓኪሞም (ስእሊ 2E–H)። TGF-β1 ሕክምና ንመጠን ኣፖፕቶሲስ ኣይቀየረን፣ ይኹን እምበር፣ IPA ሓባራዊ ሕክምና ምስ TGF-β1 ሕክምና ክነጻጸር እንከሎ ደንጉዩ ዝመጽእ ኣፖፕቶሲስን ደረጃ ኣፖፕቶሲስን (%) ወሲኹ (ስእሊ 2E–H)። እዞም ውጽኢታት 1 ሚሊ ሜተር IPA ካብ TGF-β1 induction ነጻ ኮይኑ ኣብ LX-2 ዋህዮታት ኣፖፕቶሲስ ከደንፍዕ ከም ዝኽእል ይሕብሩ።
ብተወሳኺ ጽልዋ IPA ኣብ ማይቶኮንድርያል ምስትንፋስ ኣብ LX-2 ዋህዮታት መርሚርናዮ። እቲ ውጽኢት ከም ዘመልክቶ፡ 1 ሚሊ ሜተር IPA ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ንመዐቀኒታት ሃልኪ ኦክስጅን (OCR)፡ ማለት ዘይ-ማይቶኮንድርያል ምትንፋስ፡ መሰረታዊን ዝለዓለን ምትንፋስ፡ ምፍሳስ ፕሮቶንን ምፍራይ ኤቲፒን ምስ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ ከም ዘጉድሎ (ስእሊ 3A, B)፡ ባዮኢነርጂቲክ ጥዕና መዐቀኒ (BHI) ግን ኣይተቐየረን።
IPA ኣብ ዋህዮታት LX-2 ንዝፍጠር ምትንፋስ ማይቶኮንድርያ ይንክዮ። ማይቶኮንድርያል ምትንፋስ መስመር (OCR) ከም ማይቶኮንድርያል ምትንፋስ መለክዒታት (ዘይ-ማይቶኮንድርያል ምስትንፋስ፣ መሰረታዊ ምትንፋስ፣ ዝለዓለ ምትንፋስ፣ ፕሮቶን ምፍሳስ፣ ኤቲፒ ምፍጣር፣ SRCን BHIን) ኮይኑ ይቐርብ። ዋህዮታት Aን Bን ብ10 μM, 100 μMን 1 mM IPAን ን24 ሰዓታት ተሓቢኦም እዮም። ዋህዮታት Cን Dን ምስ TGF-β1 (5 ng/ml)ን 1 mM IPAን ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ን24 ሰዓታት ብቕደም ተኸተል ተሓቢኦም እዮም። ኩሎም መለክዒታት ብሳይክዋንት ኪት ተጠቒሞም ናብ ትሕዝቶ ዲኤንኤ ንቡር ተገይሮም እዮም። BHI: ባዮኢነርጂቲክ ጥዕና መዐቀኒ፤ SRC: ናይ ምስትንፋስ ዕቑር ዓቕሚ፤ OCR: መጠን ሃልኪ ኦክስጅን። መረዳእታታት ከም ማእከላይ ± መደበኛ ምዝንባል (SD)፣ n = 5 ነጻ ፈተነታት ይቐርቡ። ስታቲስቲካዊ ንጽጽር ብሓደ-ኣንፈት ANOVAን Bonferroni post hoc testን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ ከምኡ’ውን ***p < 0.001
ዝያዳ ኩለመዳያዊ ርድኢት ናይ IPA ኣብ bioenergetic ፕሮፋይል TGF-β1-activated LX-2 ዋህዮታት, ንሕና mitochondrial oxidative phosphorylation ብ OCR (ስእሊ. 3C, D) ተንቲንና። እቲ ውፅኢት ከምዘመላኽቶ TGF-β1 ሕክምና ምስቲ ቁፅፅር ጉጅለ እንትነፃፀር ዝለዓለ ናይ ምስትንፋስ፣ ዕቑር ዓቕሚ ምስትንፋስ (SRC)ን BHIን ከጉድል ይኽእል እዩ (ስእሊ 3C,D)። ብተወሳኺ እቲ ውህደት ሕክምና ንመሰረታዊ ምትንፋስ፣ ምፍሳስ ፕሮቶንን ምፍራይ ኤቲፒን ኣጉዲሉ፣ እንተኾነ ግን SRCን BHIን ካብቶም ብTGF-β1 ዝተሓከሙ ብኣግባቡ ዝለዓለ እዩ ነይሩ (ስእሊ 3C,D)።
ብተወሳኺ ብሲሆርስ ሶፍትዌር ዝተዋህበ “ሴሉላር ኢነርጂ ፊኖታይፕ ቴስት” (ተወሰኽቲ ስእሊ 4A–D) ኣካይድና። ከምቲ ኣብ ተወሳኺ ስእሊ 3B ንርእዮ ዘለና ድሕሪ TGF-β1 ሕክምና ክልቲኦም OCRን ECARን metabolic potentials ነክዮም እዮም፣ ይኹን እምበር ኣብቶም ውህደትን IPAን ሕክምና ጉጅለታት ምስቲ ቁፅፅር ጉጅለ እንትነፃፀር ፍልልይ ኣይተራእየን። ካብዚ ብተወሳኺ ድሕሪ ውህደትን IPAን ሕክምና ክልቲኦም መሰረታዊን ጸቕጢን ደረጃታት OCR ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ ነክዩ (ተመላላኢ ስእሊ 4C)። እቲ ዝገርም፡ ተመሳሳሊ ቅዲ ምስ ውህደት ፍወሳ ተራእዩ፡ ኣብዚ ምስ TGF-β1 ሕክምና ክነጻጸር እንከሎ ኣብ መሰረታዊን ደረጃ ጸቕጥን ECAR ዝኾነ ለውጢ ኣይተራእየን (ተመላላኢ ስእሊ 4C)። ኣብ HSCs ምጉዳል ማይቶኮንድርያል ኦክሲዳቲቭ ፎስፎርላይዜሽንን ድሕሪ ምቅላዕ TGF-β1 ሕክምና SCRን BHIን ንምምላስ ናይ ውህደት ሕክምና ዓቕምን ነቲ ናይ ምምሕያሽ ዓቕሚ ኣይቀየሮን (OCR and ECAR)። እዞም ውጽኢታት ብሓባር እንተተራእዮም፡ IPA ኣብ HSCs ባዮኢነርጂቲክስ ከጉድል ከምዝኽእል ይሕብሩ፡ እዚ ድማ IPA ንHSC ፊኖታይፕ ናብ ዘይምንቅስቓስ ዘሰጋግር ታሕተዋይ ጸዓት ፕሮፋይል ከለዓዕል ከምዝኽእል ይሕብር (ተመላላኢ ስእሊ 4D)።
ጽልዋ IPA ኣብ ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስ ሰለስተ-መኣዝናዊ ቁጽሪ ናይ ማይቶኮንድርያል ሞርፎሎጂን መርበብ ምትእስሳርን ከምኡ’ውን MTR ምልካይ (ስእሊ 4ን ተወሳኺ ስእሊ 5ን) ተጠቒምካ ተፈቲኑ። ስእሊ 4 ከምዘርእዮ፡ ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ሕክምና TGF-β1 ማእከላይ ስፍሓት ገጽ፡ ቁጽሪ ጨንፈር፡ ጠቕላላ ንውሓት ጨንፈርን ቁጽሪ መጋጠሚ ጨንፈርን ከም ዘጉደለ (ስእሊ 4A and B) ከምኡ’ውን ብዝሒ ማይቶኮንድርያ ካብ ክቢ ናብ ማእከላይ ሞርፎሎጂ ከም ዝቐየረ (ስእሊ 4C)። ሕክምና IPA ጥራይ እዩ ማእከላይ መጠን ማይቶኮንድርያ ኣጉዲሉን ምስ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ ብዝሒ ማይቶኮንድርያ ካብ ክቢ ናብ ማእከላይ ሞርፎሎጂ ቀይሩን (ስእሊ 4A)። ብኣንጻሩ፡ ብማይቶኮንድርያል ሽፋን ዓቕሚ-ዝምርኮስ MTR (ስእሊ 4Aን Eን) ዝተገምገመ ክቢነት፡ ማእከላይ ንውሓት ጨንፈርን ማይቶኮንድርያል ንጥፈትን ከም ዘይተቐየረን እዞም መለክዒታት ኣብ መንጎ ጉጅለታት ኣይተፈላለዩን። እዞም ውጽኢታት ብሓባር እንተተራእዮም፡ TGF-β1ን IPAን ሕክምና ቅርጽን ዓቐንን ማይቶኮንድርያ ከምኡ’ውን ኣብ ህያዋን LX-2 ዋህዮታት ንዝህሉ ውስብስብነት መርበብ ዝቕይር ይመስል።
IPA ኣብ ዋህዮታት LX-2 ንዝርከብ ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስን ማይቶኮንድርያል ዲኤንኤ ብዝሒን ይቕይር። A. ተወካሊ ኮንፎካል ምስልታት ህያዋን LX-2 ዋህዮታት ምስ TGF-β1 (5 ng/ml)ን 1 mM IPAን ን24 ሰዓታት ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ዝተሓብኡ ማይቶኮንድርያል መርበባት ብMitotrackerTM Red CMXRos ዝተለኽዩን ኒውክለሳት ሰማያዊ ብDAPI ዝተለኽዩን ዘርኢ። ኩሉ ዳታ ብውሑዱ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ጉጅለ 15 ምስልታት ዝሓዘ እዩ። ንነፍሲ ወከፍ ዓይነት ናሙና 10 Z-stack ምስልታት ኣጥሪና። ነፍሲ ወከፍ Z-axis መስርዕ 30 ስላይስ ዝሓዘ ኮይኑ፡ ነፍሲ ወከፎም 9.86 μm ርጉድና ነይርዎም። ስኬል ባር: 10 ማይክሮሜትር። B. ኣብቲ ምስሊ ተዓጻጻፊ ደረት ብምትግባር ዝተለለዩ ተወከልቲ ነገራት (ማይቶኮንድርያ ጥራይ)። ብዝሒ ትንተናን ምውድዳርን ማይቶኮንድርያል ሞርፎሎጂካዊ መርበብ ምትእስሳር ንኹሎም ዋህዮታት ኣብ ነፍሲ ወከፍ ጉጅለ ተኻይዱ። ሐ.ፍሪኩዌንሲ ናይ ማይቶኮንድርያል ቅርጺ ሬሽዮታት። ናብ 0 ዝቐረቡ ክብርታት ክቢ ቅርጽታት ዘመልክቱ ኮይኖም፡ ናብ 1 ዝቐረቡ ክብርታት ድማ ፊላሜንታስ ቅርጽታት ዘመልክቱ እዮም። D ትሕዝቶ ማይቶኮንድርያል ዲኤንኤ (mtDNA) ከምቲ ኣብ ንብረትን ኣገባባትን ዝተገልጸ እዩ ተረጋጊጹ። E MitotrackerTM Red CMXRos ትንተና ከምቲ ኣብ ንብረትን ኣገባባትን ዝተገልጸ ብፍሎው ሳይቶሜትሪ (30,000 ፍጻመታት) ተኻይዱ። መረዳእታታት ብማእኸላይ ± SD, n = 3 ነፃ ፈተነታት ይቐርቡ። ስታቲስቲካዊ ንጽጽር ብሓደ-ኣንፈት ANOVAን Bonferroni post hoc testን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ ***p < 0.001፤ ****p < 0.0001 እዩ።
ብድሕሪኡ ኣብ LX-2 ዋህዮታት ዝርከብ ትሕዝቶ mtDNA ከም መርኣዪ ቁጽሪ ማይቶኮንድርያ ተንቲንናዮ። ምስቲ ቁጽጽር ዝገበረ ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብቲ ብTGF-β1 ዝተሓከመ ጉጅለ፡ ትሕዝቶ mtDNA ወሰኸ (ስእሊ 4D)። ምስቲ ብTGF-β1 ዝተሓከመ ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብቲ ውህደት ዝተሓከመ ጉጅለ፡ ትሕዝቶ mtDNA ከምዝነከየ (ስእሊ 4D)፡ እዚ ድማ IPA ትሕዝቶ mtDNAን ምናልባት’ውን ቁጽሪ ማይቶኮንድርያን ከምኡ’ውን ምትንፋስ ማይቶኮንድርያን ከጉድል ከምዝኽእል ይሕብር (ስእሊ 3C)። ብተወሳኺ፡ IPA ኣብቲ ውሁድ ሕክምና ንዘሎ ትሕዝቶ mtDNA ዝቕንስ ይመስል ግን ብMTR-mediated mitochondrial activity ጽልዋ ኣይነበሮን (ስእልታት 4A–C)።
ምትእስሳር IPA ምስ ደረጃታት mRNA ናይ ጂናት ምስ ፋይብሮሲስ፣ ኣፖፕቶሲስ፣ ብህይወት ምንባርን ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስን ኣብ LX-2 ዋህዮታት ዝተኣሳሰሩ መርሚርናዮ (ስእሊ 5A–D)። ምስቲ ቁጽጽር ዝገበረ ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ እቲ ብTGF-β1 ዝተሓከመ ጉጅለ፡ ከም ኮላጀን ዓይነት I α2 ሰንሰለት (COL1A2)፡ α-ስሙት ጭዋዳ ኣክቲን (αSMA)፡ ማትሪክስ ሜታሎፕሮቲነዝ 2 (MMP2)፡ ቲሹ ኢንሂቢተር ሜታሎፕሮቲነዝ 1 (TIMP1)፡ ከምኡ’ውን ዳይናሚን 1 ዝመስል ጂን (DRP1) ዝኣመሰሉ ጂናት ምውሳኽ ኣርእዩ ፋይብሮሲስን ምንቅስቓስን ምዃኑ’ዩ። ካብዚ ብተወሳኺ ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ሕክምና TGF-β1፡ ደረጃ mRNA ናይ ኒዩክለር ፕረግነን ኤክስ ተቐባሊ (PXR)፡ ካስፓዝ 8 (CASP8)፡ MAPKAPK3፡ ተዓጻጻፊ B-cell α፡ ምዕባይ ኒዩክለራዊ ረቛሒ κ ጂን ብርሃን ፔፕታይድ (NFκB1A)፡ ከምኡ’ውን ተዓጻጻፊ ኒዩክለራዊ ረቛሒ κB kinase ንኡስ ኣሃዱ β (IKBKB) ኣጉዲሉ (ስእሊ 5A–D)። ምስ TGF-β1 ሕክምና ክነጻጸር እንከሎ፡ ውህደት ሕክምና ብTGF-β1ን IPAን ንመግለጺ COL1A2ን MMP2ን ኣጉዲሉ፡ እንተኾነ ግን ደረጃ mRNA PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, and IKBKB ወሲኹ። IPA ሕክምና ንመግለጺ MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), ከምኡ’ውን mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) ብዓቢኡ ክጎድል እንከሎ፡ መግለጺ CASP8, NFκB1A, NFκB1B, IKBKB ግን ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ ወሰኸ። ይኹን እምበር ኣብ መግለጺ ካስፓዝ-3 (CASP3)፡ ኣፖፕቶቲክ ፔፕቲደዝ ኣክቲቬቲንግ ፋክተር 1 (APAF1)፡ ማይቶኮንድርያል ፍዩዥን ፕሮቲን 1 (MFN1)፡ ከምኡ’ውን ፊሽን ፕሮቲን 1 (FIS1) ዝኾነ ፍልልይ ኣይተረኽበን። እዞም ውጽኢታት ብሓባር፡ ሕክምና IPA ምስ ፋይብሮሲስ፡ ኣፖፕቶሲስ፡ ብህይወት ምንባርን ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስን ዝተኣሳሰሩ ጂናት መግለጺ ከም ዝቕይር ይሕብሩ። ዳታና ከም ዝሕብሮ፡ ሕክምና IPA ኣብ ዋህዮታት LX-2 ፋይብሮሲስ ከም ዝንክዮ፤ ማዕረ ማዕሪኡ ድማ ነቲ ፊኖታይፕ ናብ ዘይምንቅስቓስ ብምስግጋር ንህይወት የነቓቕሕ።
IPA ኣብ ዋህዮታት LX-2 ንመግለጺ ጂናት ፋይብሮብላስት፣ ኣፖፕቶቲክ፣ ህያውነትን ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስን ይቕይር። ሂስቶግራማት ድሕሪ LX-2 ዋህዮታት ብTGF-β1ን IPAን ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ን24 ሰዓታት ምልዕዓል ብተዛማዲ ምስ ውሽጣዊ ቁጽጽር (RPLP0 ወይ PPIA) መግለጺ mRNA የርእዩ። A ፋይብሮብላስትስ፣ B ኣፖፕቶቲክ ዋህዮታት፣ C ብህይወት ዝተረፉ ዋህዮታት፣ D ድማ ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስ ጂን መግለጺ የመልክት። መረዳእታታት ከም ማእከላይ ± መደበኛ ምዝንባል (SD)፣ n = 3 ነጻ ፈተነታት ይቐርቡ። ስታቲስቲካዊ ንጽጽር ብሓደ-ኣንፈት ANOVAን Bonferroni post hoc testን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ ***p < 0.001፤ ****p < 0.0001 እዩ።
ብድሕሪኡ፡ ለውጢ ኣብ ስፍሓት ዋህዮታት (FSC-H)ን ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነት (SSC-H)ን ብፍሎው ሳይቶሜትሪ (ስእሊ 6A,B) ተገምጊሙ፡ ድሕሪ ሕክምና IPA ዝመጽእ ለውጢ ሞርፎሎጂ ዋህዮታት ድማ ብትራንስሚሽን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM)ን ፌዝ ኮንትራስት ማይክሮስኮፒን (ተመላላኢ ስእሊ 6A-B) ተገምጊሙ። ከምቲ ትጽቢት ዝተገብረሉ፡ ኣብቲ ብTGF-β1 ዝተሓከመ ጉጅለ ዝነበሩ ዋህዮታት ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸሩ ከለዉ ብዓቐን ወሲኾም (ስእሊ 6A,B)፡ እዚ ድማ ክላሲካል ምስፍሕፋሕ ረሳሕ ኢንዶፕላዝማዊ ረቲኩለም (ER *)ን ፋጎሊሶሶማትን (P) ዘርኢ ኮይኑ፡ እዚ ድማ ንጥፈት ደም-ፖየቲክ ስቴም ሴል (HSC) ዘመልክት እዩ (ተመላላኢ ስእሊ 6A)። ይኹን እምበር ምስቲ ብTGF-β1 ዝተሓከመ ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብቲ ብTGF-β1ን IPAን ዝተሓከመ ጉጅለ፡ ዓቐን ዋህዮ፡ ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነት (ስእሊ 6A,B)፡ ከምኡ’ውን ትሕዝቶ ER* ነክዩ (ተመላላኢ ስእሊ 6A)። ካብዚ ብተወሳኺ ሕክምና IPA ምስቲ ቁፅፅር ጉጅለ እንትነፃፀር ንዓቐን ዋህዮታት፣ ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነት (ስእልታት 6A,B)፣ ትሕዝቶ Pን ER*ን (ተመላላኢ ስእሊ 6A) ኣጉዲሉ። ብተወሳኺ፡ ትሕዝቶ ኣፖፕቶቲክ ዋህዮታት ድሕሪ 24 ሰዓታት ሕክምና IPA ምስቲ ቁጽጽር ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ ወሰኸ (ጻዕዳ ፍላጻታት፡ ተወሳኺ ስእሊ 6B)። ብሓባር እዞም ውጽኢታት 1 ሚሊ ሜተር IPA ንHSC apoptosis ከነቓቕሕን ነቲ ብTGF-β1 ዝለዓዓል ለውጢ ኣብ ሞርፎሎጂካዊ መለክዒታት ዋህዮታት ክመልሶን ከምዝኽእልን፡ በዚ ድማ ንዓቐንን ዝተሓላለኸነትን ዋህዮታት ክቆጻጸር ከምዝኽእልን እዚ ድማ ምስ HSC inactivation ዝተኣሳሰር ክኸውን ከምዝኽእልን ይሕብሩ።
IPA ኣብ LX-2 ዋህዮታት ንዓቐን ዋህዮታትን ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነትን ይቕይር። ተወከልቲ ምስልታት ፍሎው ሳይቶሜትሪ ትንተና። እቲ ትንተና ንLX-2 ዋህዮታት ፍሉይ ዝኾነ gating ስትራተጂ ተጠቒሙ፡ SSC-A/FSC-A ንህዝቢ ዋህዮታት ንምግላጽ፡ FSC-H/FSC-A ንደብሌት ንምልላይ፡ ከምኡ’ውን SSC-H/FSC-H ንዓቐንን ውስብስብነትን ትንተና። ዋህዮታት ምስ TGF-β1 (5 ng/ml)ን 1 mM IPAን ኣብ ሴረም-ነጻ ማእከላይ ን24 ሰዓታት ተሓቢኦም እዮም። LX-2 ዋህዮታት ንዓቐን ዋህዮታትን ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነትን ትንተና ኣብ ታሕተዋይ ጸጋማይ ርብዒ (SSC-H-/FSC-H-)፡ ላዕለዋይ ጸጋማይ ርብዒ (SSC-H+/FSC-H-)፡ ታሕተዋይ የማናይ ርብዒ (SSC-H-/FSC-H+)፡ ከምኡ’ውን ላዕለዋይ የማናይ ርብዒ (SSC-H+/FSC-H+) ተዘርጊሖም። B. ሞርፎሎጂ ዋህዮታት ብፍሎው ሳይቶሜትሪ FSC-H (ንቕድሚት ፋሕፋሕ፣ ዓቐን ዋህዮ)ን SSC-H (ጎድናዊ ፋሕፋሕ፣ ሳይቶፕላዝማዊ ውስብስብነት)ን (30,000 ፍጻመታት) ተጠቒምካ ተተንቲኑ። መረዳእታታት ብማእኸላይ ± SD, n = 3 ነፃ ፈተነታት ይቐርቡ። ስታቲስቲካዊ ንጽጽር ብሓደ-ኣንፈት ANOVAን Bonferroni post hoc testን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ ***p < 0.001 ከምኡ እውን ****p < 0.0001 እዩ።
ከም IPA ዝኣመሰሉ ናይ መዓንጣ መተቦላይትስ ውዑይ ኣርእስቲ መጽናዕቲ ኮይኖም ኣለዉ፡ እዚ ድማ ኣብ ማይክሮባዮታ መዓንጣ ሓደስቲ ዕላማታት ክረኽቡ ከምዝኽእሉ ይሕብር። ስለዚ ኣብ ደቂ ሰባት ምስ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዘተኣሳስርናዮ መተቦላይት IPA [15] ኣብ ሞዴላት እንስሳታት ጸረ-ፋይብሮቲክ ውህደት ክኸውን ከም ዝኽእል ተረጋጊጹ ምህላዉ ኣገዳሲ እዩ [13, 14]። ኣብዚ፡ ንመጀመርታ ግዜ ኣብ መንጎ ሴረም IPAን ዓለማዊ ትራንስክሪፕቶሚክስ ጸላም ከብድን ዲኤንኤ ሜቲለሽንን ኣብ ስብሒ ዘለዎም ውልቀሰባት ብዘይ ዓይነት 2 ሕማም ሽኮር (T2D) ምትእስሳር ነርኢ፡ ኣፖፕቶሲስ፡ ማይቶፋጂን ነዊሕ ዕድመን፡ ከምኡ’ውን ክኸውን ዝኽእል ሕጹይ ጂን AKT1 ንሆሞስታሲስ ጸላም ከብዲ ዝቆጻጸር ዘጉልሕ። ካልእ ሓድሽ ነገር ናይ መጽናዕትና፡ ኣብ LX-2 ዋህዮታት ናይ IPA ሕክምና ምስ ኣፖፕቶሲስ፡ ሞርፎሎጂ ዋህዮታት፡ ማይቶኮንድርያል ባዮኢነርጀቲክስን ዳይናሚክስን ዘለዎ ምትእስሳር ዘርኣና ኮይኑ፡ እዚ ድማ ንHSC ፊኖታይፕ ናብ ዘይምንቅስቓስ ዘሰጋግር ትሑት ጸዓት ስፔክትረም ዘመልክት ኮይኑ፡ IPA ንፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ንምምሕያሽ ተኽእሎ ዘለዎ ሕጹይ ይገብሮ።
ኣፖፕቶሲስ፡ ማይቶፋጂን ነዊሕ ዕድመን ምስ ዝዘውር ሴረም IPA ዝተኣሳሰሩ ብጂናት ጸላም ከብዲ ዝሃብተሙ ኣገደስቲ ቀኖናዊ መንገድታት ምዃኖም ረኺብናዮ። ምዝባዕ ስርዓተ ምቁጽጻር ጽሬት ማይቶኮንድርያ (MQC) ናብ ምዝንባዕ ስራሕ ማይቶኮንድርያ፣ ማይቶፋጂን ኣፖፕቶሲስን ከስዕብ ይኽእል፣ በዚ ድማ ንኽኽሰት MASLD የደንፍዕ[33, 34]። ስለዚ፡ IPA ብኣፖፕቶሲስ፡ ማይቶፋጂን ነዊሕ ዕድመን ኣብ ጸላም ከብዲ ኣቢሉ፡ ዳይናሚክስ ዋህዮታትን ምሉእነት ማይቶኮንድርያን ኣብ ምዕቃብ ክሳተፍ ከም ዝኽእል ክንግምት ንኽእል። ዳታና ከም ዘመልክቶ፡ ኣብ መላእ እቶም ሰለስተ መርመራታት ክልተ ጂናት ልሙዳት እዮም ነይሮም፡ YKT6ን AKT1ን። YKT6 ኣብ መስርሕ ምትሕውዋስ ሽፋን ዋህዮታት ዝሳተፍ SNARE ፕሮቲን ምዃኑ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ። ኣብ ኣውቶፋጎዞም ምስ STX17ን SNAP29ን ናይ ምጅማር ውህደት ብምፍጣር ኣብ ኣውቶፋጂን ማይቶፋጂን ተራ ይጻወት፣ በዚ ድማ ምትሕውዋስ ኣውቶፋጎዞምን ላይሶዞምን የደንፍዕ[35]። ብተወሳኺ፡ ምጥፋእ ስራሕ YKT6 ውጽኢቱ ምጉዳል ማይቶፋጂ[36] ክኸውን ከሎ፡ ምውሳኽ ምቁጽጻር YKT6 ምስ ምዕባለ ሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ (HCC) ዝተኣሳሰር ኮይኑ፡ ምውሳኽ ብህይወት ምንባር ዋህዮታት የርኢ[37]። ብኻልእ ወገን ድማ AKT1 እቲ ኣገዳሲ መስተጋብራዊ ጂን ኮይኑ ኣብ ሕማማት ጸላም ከብዲ ኣገዳሲ ተራ ይጻወት፣ ንኣብነት PI3K/AKT ምልክት መንገዲ፣ ዑደት ዋህዮታት፣ ስደት ዋህዮታት፣ ምብዛሕ፣ ፎካላዊ ተጣብቕነት፣ ስራሕ ማይቶኮንድርያን ምፍሳስ ኮላጅንን[38–40]። Activated PI3K/AKT signaling pathway ን hematopoietic stem cells (HSCs) ከንቀሳቕስ ይኽእል እዩ፣ እዚኦም ድማ ንኤክስትራሴሉላር ማትሪክስ (ECM) ንምፍራይ ሓላፍነት ዝስከሙ ዋህዮታት እዮም፣ ምዝንባዕ ምቁጽጻር ድማ ኣብ ምኽሳትን ምዕባለን ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ኣበርክቶ ክህልዎ ይኽእል[40]። ብተወሳኺ፡ AKT ሓደ ካብቶም ኣብ p53 ዝምርኮስ ዋህዮታት ኣፖፕቶሲስ ዝዓግቱ ቀንዲ ረቛሒታት ህይወት ዋህዮታት ኮይኑ፡ AKT activation ድማ ምስ ምዕጋት ኣፖፕቶሲስ ዋህዮታት ጸላም ከብዲ ዝተኣሳሰር ክኸውን ይኽእል እዩ[41, 42]። እቲ ዝተረኽበ ውጽኢት ከም ዝሕብሮ፡ IPA ኣብ መንጎ ምእታው ኣፖፕቶሲስ ወይ ብህይወት ምንባር ንውሳነ ዋህዮታት ጸላም ከብዲ ብምጽላው ኣብ ምስ ማይቶኮንድርያ ጸላም ከብዲ ዝተኣሳሰር ኣፖፕቶሲስ ክሳተፍ ከም ዝኽእል ይሕብር። እዞም ጽልዋታት ብAKTን/ወይ YKT6ን ሕጹያት ጂናት ክመሓደሩ ይኽእሉ፡ እዚኦም ድማ ንሆሞስታሲስ ጸላም ከብዲ ወሳኒ እዮም።
ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ 1 ሚሊ ሜተር IPA ካብ TGF-β1 ሕክምና ነጻ ዝኾነ ኣብ LX-2 ዋህዮታት ኣፖፕቶሲስን ምንካይ ማይቶኮንድርያል ምትንፋስን ከም ዘስዓበ ኣረጋጊጹ። ኣፖፕቶሲስ ንፍታሕ ፋይብሮሲስን ምንቅስቓስ ሄማቶፖየቲክ ስቴም ሴል (HSC) ቀንዲ መንገዲ ምዃኑን፡ ኣብቲ ንድሕሪት ዝምለስ ፊዚዮሎጂካዊ ምላሽ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ እውን ቁልፊ ፍጻመ ምዃኑን ኣገዳሲ እዩ [4, 43]። ብተወሳኺ፡ ድሕሪ ውህደት ሕክምና ኣብ ዋህዮታት LX-2 ምምላስ BHI፡ IPA ኣብ ምቁጽጻር ማይቶኮንድርያል ባዮኢነርጀቲክስ ክህልዎ ዝኽእል ተራ ሓድሽ ርድኢት ሂቡ። ኣብ ትሕቲ ዕረፍትን ዘይንጡፍን ኩነታት፡ ዋህዮታት ደም ዝፈጥሩ ንቡር ማይቶኮንድርያል ኦክሲዳቲቭ ፎስፎርላይዜሽን ተጠቒሞም ኤቲፒ የፍርዩን ትሑት ንጥፈታት ምምሕያሽ መግቢ ኣለዎም። ብኻልእ ወገን ድማ HSC activation ንናይ ማይቶኮንድርያል ምትንፋስን ባዮሲንተሲስን ብምዕባይ ነቲ ናብ ግላይኮላይቲክ ኩነታት ንምእታው ዝጠልቦ ጸዓት ይኽሕስ [44]። IPA ንመቦሊክ ዓቕሚን ECARን ጽልዋ ከምዘይገበረን፡ እቲ ግላይኮላይቲክ መንገዲ ቀዳምነት ከምዘይወሃቦ ይሕብር። ብተመሳሳሊ ካልእ መፅናዕቲ 1 ሚሊ ሜትር IPA ኣብ ካርዲዮማይዮሳይት፣ መስመር ዋህዮታት ዋህዮታት ዋህዮታት ፀላም ከብዲ ሰብ (Huh7)ን ዋህዮታት ኢንዶተልያል ሰራውር ሕቝፊ ሰብን (HUVEC) ንንጥፈታት ማይቶኮንድርያል ሰንሰለት ስርዓተ ምስትንፋስ ክቕይር ከምዝኸኣለ፤ ይኹን እምበር፡ IPA ኣብ ግላይኮላይሲስ ኣብ ካርዲዮማይዮሳይት ዝኾነ ጽልዋ ኣይተረኽበን፡ እዚ ድማ IPA ንባዮኢነርጀቲክስ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት ክጸልዎ ከም ዝኽእል ይሕብር [45]። ስለዚ 1 ሚሊ ሜትር IPA መጠን mtDNA ከይቀየረ ንፋይብሮጀኒክ ጂን መግለጺ፣ ሞርፎሎጂ ዋህዮታትን ማይቶኮንድርያል ባዮኢነርጀቲክስን ብዓቢኡ ክቕንስ ስለዝኽእል ከም ልኡም ኬሚካላዊ መተሓላለፊ ክሰርሕ ከምዝኽእል ንግምት [46]። ማይቶኮንድርያል ኣንኮፕለርስ ብባህሊ ዝመጽእ ፋይብሮሲስን ኤችኤስሲ ኣክቲቬሽንን ክዓግቱ ይኽእሉ [47] ከምኡ’ውን ብገለ ፕሮቲናት ከም ኣንኮፕሊንግ ፕሮቲናት (UCP) ወይ ኣዴኒን ኒውክሊዮታይድ ትራንስሎኬዝ (ANT) ዝምራሕ ወይ ዝለዓዓል ምፍራይ ማይቶኮንድርያል ኤቲፒ ክቕንሱ ይኽእሉ። እዚ ተርእዮ ከከም ዓይነት ዋህዮታት ንዋህዮታት ካብ ኣፖፕቶሲስ ክከላኸልን/ወይ ድማ ኣፖፕቶሲስ ከደንፍዕን ይኽእል [46]። ይኹን እምበር፡ ተራ IPA ከም ማይቶኮንድርያል ኣንኮፕለር ኣብ ሄማቶፖየቲክ ስቴም ሴል ኢንኣክቲቬሽን ንምብራህ ተወሳኺ መጽናዕትታት የድሊ።
ብድሕሪኡ ኣብ ምትንፋስ ማይቶኮንድርያ ዝመጽእ ለውጢ ኣብ ህያዋን ዋህዮታት LX-2 ኣብ ሞርፎሎጂ ማይቶኮንድርያ ይንጸባረቕ ድዩ ኣይንጸባረቕን መርሚርናዮ። እቲ ዝገርም፡ TGF-β1 ሕክምና ንመጠን ማይቶኮንድርያ ካብ ክቢ ናብ ማእከላይ ይቕይሮ፡ ምስ ምንካይ ጨንፈር ማይቶኮንድርያን ምውሳኽ መግለጺ DRP1ን፡ እዚ ድማ ኣብ ምብትታን ማይቶኮንድርያ ቁልፊ ረቛሒ እዩ [48]። ካብዚ ብተወሳኺ ምብትታን ማይቶኮንድርያል ምስ ሓፈሻዊ ውስብስብ መርበብ ዝተኣሳሰር ኮይኑ፡ ካብ ፍዩዥን ናብ ምብትታን ዝግበር ምስግጋር ንሄማቶፖየቲክ ስቴም ሴል (HSC) activation ወሳኒ ክኸውን ከሎ፡ ምዕጋት ምብትታን ማይቶኮንድርያ ግን ናብ HSC apoptosis ይመርሕ [49]። ስለዚ፡ ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ TGF-β1 ሕክምና ምስ ምንካይ ጨንፈር ምጉዳል ኣብ ማይቶኮንድርያል መርበብ ውስብስብነት ከለዓዕል ይኽእል እዩ፡ እዚ ድማ ኣብ ማይቶኮንድርያል ምብትታን ምስ ንጡፋት ሄማቶኮንድርያል ስቴም ሴልስ (HSCs) ዝተኣሳሰር ዝያዳ ልሙድ እዩ። ካብዚ ሓሊፉ፡ ዳታና ከም ዘመልክቶ፡ IPA ብዝሒ ማይቶኮንድርያ ካብ ክቢ ናብ ማእከላይ ቅርጺ ክቕይር ከም ዝኽእልን፡ በዚ ድማ መግለጺ OPA1ን MFN2ን ክቕንስ ይኽእል። መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ፡ ምውራድ OPA1 ምጉዳል ዓቕሚ ሽፋን ማይቶኮንድርያ ከስዕብን ኣፖፕቶሲስ ዋህዮታት ከበግስን ይኽእል እዩ[50]። MFN2 ንማይቶኮንድርያል ፍዩዥንን ኣፖፕቶሲስን ከም ዝሽምግል ይፍለጥ[51]። እቲ ዝተረኽበ ውጽኢት ከም ዝሕብሮ፡ ምልዕዓል ዋህዮታት LX-2 ብTGF-β1ን/ወይ IPAን ቅርጽን ዓቐንን ማይቶኮንድርያ፡ ከምኡ’ውን ንኹነታት ምንቅስቓስን ውስብስብነት መርበብን ዝቕይር ይመስል።
ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ ውህደት ሕክምና TGFβ-1ን IPAን ኣብ ኣፖፕቶሲስ ዝሃድሙ ዋህዮታት ንመግለጺ mRNA ፋይብሮሲስ፡ ኣፖፕቶሲስን ምስ ምድሓን ዝተኣሳሰሩ ጂናት ብምቁጽጻር mtDNAን ሞርፎሎጂካዊ መለክዒታት ዋህዮታትን ከጉድል ከም ዝኽእል ይሕብር። ብርግጽ IPA ንደረጃ መግለጺ mRNA AKT1ን ኣገደስቲ ጂናት ፋይብሮሲስን ከም COL1A2ን MMP2ን ኣጉዲሉ፡ ምስ ኣፖፕቶሲስ ዝተኣሳሰር ደረጃ መግለጺ CASP8 ግን ኣዕብዩ። ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ ድሕሪ ሕክምና IPA፡ መግለጺ BAX ከም ዝነከየን፡ መግለጺ mRNA ናይ TIMP1 ስድራቤት ንኡሳን ኣሃዱታት፡ BCL-2ን NF-κBን ከም ዝወሰኸን፡ እዚ ድማ IPA ኣብ ኣፖፕቶሲስ ዝሃድሙ ዋህዮታት ደም (HSCs) ናይ ምድሓን ምልክታት ከነቓቕሕ ከም ዝኽእል ይሕብር። እዞም ሞለኪዩላት ኣብ ንጡፋት ዋህዮታት ደም ዝፈጥሩ ስቴም ከም ፕሮ-ሰርቫይቫል ምልክታት ኮይኖም ክሰርሑ ይኽእሉ፣ እዚ ድማ ምስ ምውሳኽ መግለጺ ጸረ-ኣፖፕቶቲክ ፕሮቲናት (ከም Bcl-2)፣ ምንካይ መግለጺ ፕሮ-ኣፖፕቶቲክ BAX፣ ከምኡ’ውን ኣብ መንጎ TIMPን NF-κBን ዝተሓላለኸ ምትሕውዋስ ዝተኣሳሰር ክኸውን ይኽእል [5, 7]። IPA ብመንገዲ PXR ውጽኢቱ የርኢ፣ ብTGF-β1ን IPAን ዝተዋሃሃደ ሕክምና ድማ ደረጃ መግለጺ PXR mRNA ከም ዝውስኽ ረኺብናዮ፣ እዚ ድማ ምዕፋን ምንቅስቓስ HSC ዘመልክት እዩ። ንጡፍ PXR ምልክት ምሃብ ንHSC ምንቅስቓስ ኣብ ክልቲኡ ኣብ vivoን in vitroን ከም ዝዓግቶ ይፍለጥ [52, 53]። ውጽኢትና ከም ዘመልክቶ፡ IPA ኣፖፕቶሲስ ብምድንፋዕ፡ ፋይብሮሲስን ማይቶኮንድርያል ሜታቦሊዝምን ብምንካይ፡ ከምኡ’ውን ናይ ምድሓን ምልክታት ብምዕባይ ኣብ ምጽራይ ዝተንቀሳቐሱ HSCs ክሳተፍ ከም ዝኽእልን፡ እዚኦም ድማ ነቲ ዝተንቀሳቐሰ HSC ፊኖታይፕ ናብ ዘይንጡፍ ዝቕይሩ ልሙዳት መስርሓት እዮም። ካልእ ክኸውን ዝኽእል መግለጺ ናይቲ ክህሉ ዝኽእል ኣገባብን ተራን IPA ኣብ ኣፖፕቶሲስ ብቐንዱ ብመንገዲ ማይቶፋጂ (intrinsic pathway) ከምኡ’ውን ብደጋዊ TNF signaling pathway (ሰንጠረዥ 1) ኣቢሉ ንዘይተሰርሑ ማይቶኮንድርያታት ይጉሕፍ፣ እዚ ድማ ብቐጥታ ምስ NF-κB survival signaling pathway ዝተኣሳሰር እዩ (ተመላላኢ ስእሊ 7)። እቲ ዝገርም ምስ IPA ዝተኣሳሰሩ ዝተሃብተሙ ጂናት ኣብ ኣፖፕቶቲክ መንገዲ ፕሮ-ኣፖፕቶቲክን ፕሮ-ሰርቫይቫልን ምልክታት ከለዓዕሉ ይኽእሉ [54]፣ እዚ ድማ IPA ምስዞም ጂናት ብምትሕብባር ነቲ ኣፖፕቶቲክ መንገዲ ወይ ብህይወት ምንባር ከለዓዕል ከምዝኽእል ይሕብር። ይኹን እምበር፡ IPA ኣብ እዋን ምንቅስቓስ HSC ብኸመይ ኣፖፕቶሲስ ወይ ብህይወት ምንባር ከም ዝድርኽን መካኒካዊ መንገድታቱን ንጹር ኣይኮነን።
IPA ካብ ናይ መግቢ ትሪፕቶፋን ብመንገዲ ማይክሮባዮታ መዓንጣ ዝፍጠር ማይክሮባያላዊ መተቦላይት እዩ። ኣብ ከባቢ መዓንጣ ጸረ-ነድሪ፡ ጸረ-ኦክስጅንን ኤፒጀነቲክን ምቁጽጻር ባህርያት ከም ዘለዎ መጽናዕትታት ይሕብሩ።[55] መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ፡ IPA ንስራሕ መከላኸሊ መዓንጣ ክቕይርን ኦክሲዳቲቭ ጸቕጢ ከጉድልን ይኽእል እዩ፡ እዚ ድማ ኣብ ከባብያዊ ፊዚዮሎጂካዊ ጽልዋታቱ ኣበርክቶ ክገብር ይኽእል።[56] ብሓቂ ክርአ ከሎ፡ IPA ብመንገዲ ዑደት ደም ናብ ዕላማ ዝገበሩ ኣካላት ይመሓላለፍ፡ IPA ድማ ተመሳሳሊ ዓቢ ኣቃውማ መተቦላይት ምስ ትሪፕቶፋን፡ ሴሮቶኒንን መውጽኢታት ኢንዶልን ስለ ዝካፈል፡ IPA ተወዳዳሪ ዕጫ ምትሕውዋስ መግቢ ዘስዕብ መቦሊክ ተግባራት የካይድ።[52] IPA ምስ ካብ ትሪፕቶፋን ዝመጹ መተቦላይትስ ኣብ ኢንዛይማት ወይ ተቐበልቲ ንዝርከቡ ናይ ምትእስሳር ቦታታት ክወዳደር ይኽእል እዩ፣ እዚ ድማ ንቡር መተቦሊክ መንገድታት ክዘርግ ይኽእል። እዚ ድማ ንመስኮት ፍወሳኡ ብዝበለጸ ንምርዳእ ኣብ ፋርማኮኪነቲካቱን ፋርማኮዳይናሚክስን ተወሳኺ መጽናዕቲ ከምዘድሊ ዘጉልሕ እዩ።[57] እዚ ኣብ ዋህዮታት ደም ዝፈጥሩ ዋህዮታት (HSCs) እውን ክኽሰት ይኽእል ድዩ ኣይክእልን ክርአ እዩ።
መጽናዕትና ገለ ድሩትነት ከም ዘለዎ ንእመን ኢና። ብፍሉይ ምስ IPA ዝተኣሳሰሩ ማሕበራት ንምምርማር፡ ዓይነት 2 ሕማም ሽኮር (T2DM) ዘለዎም ሕሙማት ኣግሊልናዮም። እዚ ድማ ንሰፊሕ ተግባራዊነት ርኽበታትና ኣብ ዓይነት 2 ሕማም ሽኮርን ምዕቡል ሕማም ጸላም ከብድን ዘለዎም ሕሙማት ከም ዝድርት ንኣምን። ዋላ እኳ ፊዚዮሎጂካዊ ትሕዝቶ IPA ኣብ ሴረም ሰብ 1–10 μM [11, 20] እንተኾነ፡ ትሕዝቶ 1 mM IPA ኣብ ዝለዓለ ዘይመርዛም ትሕዝቶ [15]ን ዝለዓለ መጠን ኣፖፕቶሲስን መሰረት ብምግባር ተመሪጹ፡ ኣብ ሚእታዊት ናይቲ ኔክሮቲክ ዋህዮ ህዝቢ ዝኾነ ፍልልይ የለን። ኣብዚ መጽናዕቲ ልዕለ-ፊዚዮሎጂካዊ ደረጃታት IPA እኳ እንተተጠቐሙ፡ ኣብዚ እዋን’ዚ ግን ብዛዕባ ውጽኢታዊ መጠን IPA ዝኾነ ምርድዳእ የለን [52]። ውጽኢትና ትርጉም ዘለዎ እኳ እንተኾነ፡ እቲ ሰፊሕ ዕጫ ምትሕውዋስ መግቢ IPA ንጡፍ መጽናዕታዊ ዓውዲ ኮይኑ ይቕጽል ኣሎ። ብተወሳኺ ኣብ መንጎ ደረጃታት ሴረም IPAን DNA methylation of liver transcriptsን ዘሎ ምትእስሳር ዝምልከት ርኽበታትና ካብ hematopoietic stem cells (HSCs) ጥራይ ዘይኮነስ ካብ ቲሹታት ጸላም ከብዲ እውን ዝተረኸበ እዩ። ንሕና ቅድሚ ሕጂ ካብ ትራንስክሪፕቶም ትንተና ዝረኸብናዮ ርኽበታት መሰረት ብምግባር ናይ ሰብ LX-2 ዋህዮታት ክንጥቀም መሪጽና IPA ምስ hematopoietic stem cell (HSC) activation [15] ዝተኣሳሰር ምዃኑ፣ HSCs ድማ ኣብ ምዕባለ ፋይብሮሲስ ጸላም ከብዲ ዝሳተፉ ቀንዲ ዋህዮታት እዮም። ጸላም ከብዲ ብብዙሓት ዓይነታት ዋህዮታት ዝቖመ ስለዝኾነ፡ ካልኦት ሞዴላት ዋህዮታት ከም ሄፓቶሳይት-ኤችኤስሲ-ኢሙን ሴል ኮ-ካልቸር ሲስተም ምስ ካስፓዝ ኣክቲቬሽንን ዲኤንኤ ምብትታንን ከምኡ’ውን ደረጃ ፕሮቲን ሓዊሱ ኣገባብ ተግባር ተደሚሩ ተራ IPAን ምስ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት ጸላም ከብዲ ዘለዎ ርክብን ንምጽናዕ ክሕሰበሉ ይግባእ።