እቲ ጽሑፍ ኣካል ናይቲ “ምምሕያሽ ተጻዋርነት ፍረታት ፍረታት ንረኽሲ ባልዕን ባልዕን” ዝብል ኣርእስቲ መጽናዕቲ ኮይኑ፡ ንኹሎም 5 ጽሑፋት ርአ
ጠንቂ ናይቲ ፋንጋስ ተኽሊ ሕማም ኔክሮሲስ ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም (Lib.) ደ ባሪ ዝተፈላለዩ ተቐበልቲ ተኽልታት ንምልካፍ ብዙሕ ደረጃታት ዘለዎ ስትራተጂ ይጥቀም። እዚ መፅናዕቲ ንሞለኪዩላዊ፣ ፊዚዮሎጂካውን ባዮኬሚካላውን ምላሽ ፋሲዮሉስ ቩልጋሪስ ኤል ብስውዶሞናስ ስክለሮቲዮረም ንዝፍጠር ጻዕዳ ሻምብቆ ንምዕባይ ከም ኣማራጺ ስትራተጂ ምሕደራ ምጥቃም ናይቲ ዲያሚን ኤል-ኦርኒታይን ዝበሃል ፕሮቲን ዘይኮነ ኣሚኖ ኣሲድ ምጥቃም ዝእምት እዩ። ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ዝተገብረ ፈተነታት ከም ዘመልክቶ፡ L-ornithine ንዕብየት ማይሰሊያል ኤስ. ካብዚ ሓሊፉ ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን ንዘጋጥም ጽንኩርነት ጻዕዳ ሻምብቆ ብዓቢኡ ከጉድሎ ይኽእል እዩ። ካብዚ ብተወሳኺ ኤል-ኦርኒታይን ንዕብየት ናይቶም ዝተሓከሙ ተኽልታት ከምዘነቓቕሐን እዚ ድማ እቲ ዝተፈተነ ትሕዝቶ ኤል-ኦርኒታይን ነቶም ዝተሓከሙ ተኽልታት ፋይቶቶክሲክ ከምዘይኮነ ዘመልክት እዩ። ብተወሳኺ፡ ኤል-ኦርኒታይን ንመግለጺ ዘይ-ኢንዛይማዊ ጸረ-ኦክስጅን (ጠቕላላ ዝፈስሱ ፊኖሊክስን ፍላቮኖይድን) ከምኡ’ውን ኢንዛይማዊ ጸረ-ኦክስጅን (ካታለዝ (CAT)፡ ፐሮክሳይድ (POX)፡ ከምኡ’ውን ፖሊፊኖል ኦክሳይድ (PPO)) ኣዕብዩ፡ መግለጺ ሰለስተ ምስ ጸረ-ኦክስጅን ዝተኣሳሰሩ ጂናት (PvCAT1, PvSOD, and PvGR) ኣዕብዩ። ካብዚ ብተወሳኺ ኣብ ሲሊኮ ትንተና ኣብ ጂኖም ኤስ ስክለሮቲዮረም ዝርከብ ፕሮቲን ኦክሳሎኣሴቴት ኣሴታይልሃይድሮለዝ (SsOAH) ከምዘሎ ተረጋጊፁ፣ እዚ ድማ ምስ ፕሮቲናት ኦክሳሎኣሴቴት ኣሴታይልሃይድሮለዝ (SsOAH) ኣስፐርጂለስ ፊጂየንሲስ (AfOAH)ን ፔኒሲሊየም ስፒን ኣዝዩ ዝመሳሰል እዩ። (PlOAH) ብመንጽር ተግባራዊ ትንተና፣ ዝተዓቀቡ ዶመይናትን ቶፖሎጂን ይርከብዎም። እቲ ዝገርም፡ ምውሳኽ L-ornithine ኣብ ድንሽ dextrose broth (PDB) medium ኣብ S. sclerotiorum mycelia ንመግለጺ SsOAH ጂን ብዓቢኡ ኣጉዲልዎ። ብተመሳሳሊ መንገዲ ካብ ዝተሓከሙ ተኽልታት ኣብ ዝተኣከበ ፋንጋስ ማይሰልያ ብመግለፂ SsOAH ጂን ብተመሳሳሊ መንገዲ ካብ ደገ ምጥቃም L-ornithine ብዓቢኡ ከምዝነከየ ተገሊፁ። ኣብ መወዳእታ፡ ምጥቃም ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ክልቲኡ ፒዲቢ ማእከላይን ዝተለኽፈ ቆጽልን ምፍሳስ ኦክሳሊክ ኣሲድ ብዓቢኡ ኣጉዲሉ። ኣብ መደምደምታ፡ ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ምዕቃብ ኩነታት ሬዶክስ ከምኡ’ውን ናይ ዝተለኽፉ ተኽልታት ምክልኻል ምላሽ ኣብ ምዕባይ ቁልፊ ተራ ኣለዎ። ውጽኢት ናይዚ መጽናዕቲ፡ ጻዕዳ ሻምብቆ ንምቁጽጻርን ኣብ ምፍራይ ፋጁልን ካልኦት ኣእካልን ዘለዎ ጽልዋ ንምቅላልን ፈጠራዊ፡ ንከባቢ ዝምችእ ሜላታት ኣብ ምምዕባል ክሕግዝ ይኽእል።
ጻዕዳ ሻምብቆ፡ ብሰንኪ ኔክሮትሮፊክ ፋንጋስ ስክለሮቲኒያ ስክለሮቲዮረም (Lib.) ደ ባሪ ዝመጽእ ኮይኑ፡ ንዓለምለኻዊ ምህርቲ ፋጁል (Phaseolus vulgaris L.) ከቢድ ሓደጋ ዘስዕብ ኣዕናዊ፡ ምህርቲ ዝቕንስ ሕማም እዩ (Bolton et al., 2006)። ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ሓደ ካብቶም ኣብ ሓመድ ዝመሓላለፉ ፋንጋስ ተኽሊ ረኽሲታት ንምቁጽጻሩ ኣጸጋሚ ኮይኑ፡ ልዕሊ 600 ዓይነታት ተኽሊ ዝሓዘ ሰፊሕ ተቐባሊ ዝርዝር ዘለዎ ኮይኑ፡ ንኣአንጋዲ ቲሹታት ብዘይፍሉይ መንገዲ ብቕልጡፍ ናይ ምሕራስ ዓቕሙ ኣለዎ (Liang and Rollins, 2018)። ኣብ ትሕቲ ዘይምቹእ ኩነታት ድማ ኣብ ዑደት ህይወቱ ወሳኒ ምዕራፍ ይሓልፍ፣ ንነዊሕ እዋን ከም ጸሊም፣ ተሪር፣ ዘርኢ ዝመስል ኣቃውማ ‘ስክለሮትያ’ ዝበሃሉ ኣብ ሓመድ ወይ ከም ጻዕዳ፣ ፍሉፍ ዕብየት ኣብ ማይሰሊየም ወይ ስቴም ፒት ናይ ዝተለኽፉ ተኽልታት ድቃስ ይጸንሕ (Schwartz et al., 2005)። S. sclerotiorum sclerotia ናይ ምፍጣር ዓቕሚ ኣለዎ፣ እዚ ድማ ኣብ ዝተለኽፈ ግራውቲ ንነዊሕ እዋን ክነብርን ኣብ እዋን ሕማም ክጸንሕን የኽእሎ (Schwartz et al., 2005)። ስክለሮቲያ ብመኣዛታት ሃብታም ኮይኑ፡ ኣብ ሓመድ ንነዊሕ እዋን ክጸንሕ ይኽእል፡ ንቐጻሊ ረኽስታት ድማ ከም ቀዳማይ ክታበት ኮይኑ የገልግል (Schwartz et al., 2005)። ኣብ ትሕቲ ምቹእ ኩነታት ስክለሮቲያ ይበቁልን ኣብ ኣየር ዝመሓላለፉ ስፖርታት የፍርዩን እዚ ድማ ንኹሉ ኣብ ልዕሊ መሬት ዝርከብ ክፋላት ናይቲ ተኽሊ ክለኽፍ ይኽእል እዩ፣ እዚ ድማ ንዕምባባታት፣ ጕንዲ ወይ ቆጽሊ ሓዊሱ ግን ኣብዚ ጥራይ ዝተሓጽረ ኣይኮነን (Schwartz et al., 2005)።
ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ነቶም ተቐበልቲ ተኽልታቱ ንምልካፍ ብዙሕ ደረጃታት ዘለዎ ስትራተጂ ይጥቀም፣ እዚ ድማ ካብ ምብቋል ስክለሮቲያ ክሳብ ምምዕባል ምልክታት ተኸታታሊ ዝተዋደደ ፍጻመታት ዘጠቓልል እዩ። ኣብ መጀመርታ S. sclerotiorum ካብ apothecia ዝበሃሉ ዕፉን ዝመስሉ ኣቃውማታት ተንጠልጢሎም ዘለዉ ስፖር (ኣስኮስፖርስ ዝበሃሉ) የፍሪ፣ እዚኦም ድማ ብኣየር ዝመሓላለፉ ኮይኖም ኣብ ዝተለኽፉ ፍርስራስ ተኽሊ ናብ ዘይንቀሳቐስ ስክለሮትያ ይምዕብሉ (Bolton et al., 2006)። ብድሕሪኡ እቲ ፋንጋስ ንፒኤች መንደቕ ዋህዮታት ተኽሊ ንምቁጽጻር፡ ምብስባስ ኢንዛይምን ወራር ቲሹን ንምድንፋዕ (Hegedus and Rimmer, 2005)፡ ከምኡ’ውን ናይቲ ተቐባሊ ተኽሊ ኦክሲዳቲቭ ምፍንጃር ንምዕፋን፡ ረቛሒ ቫይረለንስ ኦክሳሊክ ኣሲድ ይፍንው። እዚ መስርሕ ኣሲድ ምግባር ንመንደቕ ዋህዮታት ተኽሊ የዳኽሞ፣ ንንቡርን ስሉጥን ኣሰራርሓ መንደቕ ፋንጋስ ዋህዮ ዘበላሸዉ ኢንዛይማት (CWDEs) ምቹእ ሃዋህው ይፈጥር፣ እዚ ድማ እቲ ረኽሲ ነቲ ኣካላዊ ዕንቅፋት ሰጊሩ ናብቲ ተቐባሊ ቲሹታት ክኣቱ የኽእሎ (Marciano et al., 1983)። ኤስ.ስክለሮቲዮረም ምስ ኣተወ፡ ከም ፖሊጋላክቱሮነዝን ሴሉላዝን ዝኣመሰሉ ብርክት ዝበሉ CWDEs ይፍንዉ፡ እዚኦም ድማ ኣብ ዝተለኽፉ ቲሹታት ንኽዝርጋሕ ዘመቻችኡን ቲሹ ኔክሮሲስ ዘስዕቡን እዮም። ምዕባለ ቁስልን ሃይፋል መንጸፍን ናብ ባህርያዊ ምልክታት ጻዕዳ ሻምብቆ ይመርሕ (Hegedus and Rimmer, 2005)። እዚ ከምዚ ኢሉ እንከሎ፡ ተቐበልቲ ተኽልታት፡ ብመገዲ ፓተርን ኣለሊዮም ተቐበልቲ (PRRs) ኣቢሎም ምስ ረኽሲ ዝተኣሳሰሩ ሞለኪዩላዊ ቅዲታት (PAMPs) ኣለልዮም፡ ኣብ መወዳእታ ድማ ንመከላኸሊ ምላሽ ዘንቀሳቕሱ ተኸታታሊ ናይ ምልክት ፍጻመታት የበግሱ።
ዋላ እኳ ንዓሰርተታት ዓመታት ጻዕርታት ምቁጽጻር ሕማማት እንተተኻየደ፡ ብሰንኪ ተጻዋርነት፡ ብህይወት ምጽናሕን ምትዕጽጻፍን ናይቲ ረኽሲ፡ ኣብ ፋጁል፡ ከም ካልኦት ንግዳዊ ኣእካል፡ ሕጽረት እኹል ተጻዋርነት ዘለዎ ጀርምፕላዝም ይቕጽል ኣሎ። ስለዚ ምሕደራ ሕማማት ኣዝዩ በዳሂ ኮይኑ፡ ውህደት ባህላዊ ልምድታት፡ ስነ-ህይወታዊ ምቁጽጻርን ኬሚካላዊ ጸረ-ፋንጋስን ዘጠቓልል ዝተዋሃሃደ፡ ብዙሕ ሸነኻት ዘለዎ ስትራተጂ ይሓትት (O’Sullivan et al., 2021)። ንጻዕዳ ሻምብቆ ብኬሚካላዊ ምቁጽጻር ዝያዳ ውጽኢታዊ ዝኾነሉ ምኽንያት ድማ ጸረ-ፋንጋስ ብትኽክልን ኣብ ትኽክለኛ ግዜን ምስ ዝለኽዩ ዝርገሐ እቲ ሕማም ብኣድማዒ መንገዲ ክቆጻጸርዎን ጽንኩርነት ረኽሲ ከጉድሉን ክሳራ ምህርቲ ከጉድሉን ስለዝኽእሉ እዩ። ይኹን እምበር ካብ መጠን ንላዕሊ ምጥቃምን ልዕሊ ዓቐን ኣብ ፋንጋስ ቐተልቲ መድሓኒት ምጽጋዕን ተጻዋርነት ዘለዎም ዓይነታት ኤስ. ስለዚ ንከባቢ ዝምችኡ ኣማራጺታት ምርካብ ቀዳምነት ዝወሃቦ ስራሕ ኮይኑ ኣሎ።
ከም ፑትረሲን፣ ስፐርሚዲን፣ ስፐርሚንን ካዳቨሪንን ዝኣመሰሉ ፖሊያሚን (PAs) ኣንጻር ብሓመድ ዝመሓላለፉ ረኽሲታት ተኽሊ ከም ተስፋ ዘለዎም ኣማራጺታት ኮይኖም ከገልግሉ ይኽእሉ፣ በዚ ድማ ኣጠቓቕማ ሓደገኛታት ኬሚካላዊ ጸረ-ፋንጋስ ምሉእ ብምሉእ ወይ ብኸፊል ከጉድሉ ይኽእሉ (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024)። ኣብ ላዕለዎት ተኽልታት፡ PAs ኣብ ብዙሓት ፊዚዮሎጂካዊ መስርሓት ይሳተፉ፡ እዚ ድማ ምምቕቓል ዋህዮታት፡ ምፍልላይ፡ ከምኡ’ውን ንኣቢዮቲካውን ባዮቲካውን ጸቕጥታት ምላሽ ይርከብዎም (Killiny and Nehela, 2020)። ከም ጸረ-ኦክስጅን ኮይኖም ክሰርሑ ይኽእሉ፣ ርእሰ-ተኣማንነት ዘለዎም ዓይነታት ኦክስጅን (ROS) ንምጉሓፍ ክሕግዙ ይኽእሉ፣ ሬዶክስ ሆሞስታሲስ ክሕልዉ ይኽእሉ (Nehela and Killiny, 2023)፣ ምስ ምክልኻል ዝተኣሳሰሩ ጂናት ከለዓዕሉ ይኽእሉ (Romero et al., 2018)፣ ዝተፈላለዩ መንገድታት ምምሕያሽ መግቢ ክቆጻጸሩ ይኽእሉ (Nehela and Killiny, 2023)፣ ንውሽጣዊ ፋይቶሆርሞናት ክቕይሩ ይኽእሉ (Nehela and Killiny, 2023 2019)፣ ስርዓታዊ ዝተረኽበ ተጻዋርነት (SAR) ይምስርቱ፣ ከምኡ’ውን ምትእስሳር ተኽልን ረኽሲን ይቆጻጸሩ (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)። ፍሉይ ኣገባባትን ተራን ፒኤታት ኣብ ምክልኻል ተኽሊ ከከም ዓሌታት ተኽሊ፣ ረኽሲ ዘስዕቡ ባእታታትን ኩነታት ከባብን ይፈላለ ምዃኑ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ። ኣብ ተኽልታት ዝበዝሐ ፒኤ ካብቲ ኣገዳሲ ፖሊኣሚን ኤል-ኦርኒታይን ባዮሲንተሳይዝ ይግበር (Killiny and Nehela, 2020)።
ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ዕብየትን ምዕባለን ተኽሊ ብዙሕ ተራ ኣለዎ። ንኣብነት ቅድሚ ሕጂ ዝተገበሩ መጽናዕትታት ከም ዘመልክትዎ ኣብ ሩዝ (Oryza sativa)፡ ኦርኒታይን ምስ ዳግመ-ምጥቃም ናይትሮጅን (Liu et al., 2018)፡ ምህርቲ ሩዝ፡ ጽሬትን ጨናን (Lu et al., 2020)፡ ከምኡ’ውን ምላሽ ጸቕጢ ማይ (Yang et al., 2000) ዝተኣሳሰር ክኸውን ይኽእል። ካብዚ ሓሊፉ፡ ካብ ደገ ዝመጽእ ምጥቃም L-ornithine ኣብ ሽኮር ቢትሮ (Beta vulgaris) (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ድርቂ ተጻዋርነት ብዓቢኡ ኣዕብዩ፡ ኣብ ቱፋሕ (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) ከምኡ’ውን ካሸው (Anacardium occidentale) ጸቕጢ ጨው ኣቃሊሉ። ተኽልታት (da Rocha et al., 2012)። ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ምክልኻል ጸቕጢ ኣቢዮቲክ ክህልዎ ዝኽእል ተራ፡ ኣብ ዝተሓከሙ ተኽልታት ኣብ ምውህላል ፕሮሊን ብዘለዎ ተሳትፎ ክኸውን ይኽእል። ንኣብነት ምስ ፕሮሊን ሜታቦሊዝም ዝተኣሳሰሩ ጂናት ከም ኦርኒታይን ደልታ ኣሚኖትራንስፈረዝ (delta-OAT)ን ፕሮሊን ዲሃይድሮጂነዝን (ProDH1 and ProDH2) ጂናት፡ ቅድሚ ሕጂ ኣብ ምክልኻል ኒኮቲያና ቤንታሚያናን ኣራቢዶፕሲስ ታልያናን ኣንጻር ዘይኣአንገድቲ ፒስዩዶሞናስ ሲሪንጌ ጽላታት (Senthil-Kumar and... ማይሶር፡ 2012)። ብኻልእ ወገን ድማ ንዕብየት ረኽሲ ዘስዕቡ ባእታታት ፋንጋስ ኦርኒታይን ዲካርቦክሳይለዝ (ODC) የድሊ (Singh et al., 2020)። ዕላማ ምግባር ODC ናይ ፉዛርየም ኦክሲስፖረም ረ. sp. lycopersici via host-induced gene silencing (HIGS) ተኽልታት ኮሚደረ ንFusarium wilt ዘለዎም ተጻዋርነት ብዓቢኡ ኣዕብዩዎ (Singh et al., 2020)። ይኹን እምበር፡ ኤክዞጀናዊ ኦርኒታይን ምጥቃም ኣንጻር ከም ፋይቶፓቶጀን ዝኣመሰሉ ባዮቲካዊ ጸቕጢ ክህልዎ ዝኽእል ተራ ብጽቡቕ ኣይተጽንዐን። ብዝያዳ ኣገዳሲ ዝኾነ ድማ፡ ጽልዋ ኦርኒታይን ኣብ ምጽዋር ሕማማትን ምስኡ ዝተኣሳሰር ባዮኬሚካላውን ፊዚዮሎጂካውን ተርእዮታትን ብዓቢኡ ኣይተዳህሰሰን ዘሎ።
ንውጽኢታዊ ስትራተጂታት ምቁጽጻር ንምምዕባል ዝተሓላለኸ ረኽሲ ኤስ.ስክለሮቲዮረም ፍረታት ፍረታት ምርዳእ ኣገዳሲ እዩ። ኣብዚ መፅናዕቲ ዳይኣሚን ኤል-ኦርኒታይን ከም ቁልፊ ረቛሒ ኣብ ምዕባይ ኣገባባት ምክልኻልን ተፃዋርነትን ተኽሊ ሌጉሜን ንረኽሲ ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ክህልዎ ዝኽእል ተራ ንምልላይ ዕላማ ጌርና ኢና። ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ርእሲ’ቲ ናይ ዝተለኽፉ ተኽልታት ናይ ምክልኻል ምላሽ ምዕባይ፡ ንኹነታት ሬዶክስ ኣብ ምዕቃብ’ውን ቁልፊ ተራ ከም ዘለዎ ንግምት። ንሕና ንኽህልዎ ዝኽእል ጽልዋታት ኤል-ኦርኒታይን ምስ ምቁጽጻር ናይ ኢንዛይማውን ዘይኢንዛይማውን ጸረ-ኦክስጅን መከላኸሊ ኣገባባትን ምትእትታው ምስ ፋንጋስ ፓቶጀኒሲቲ/ቫይረለንስ ረቛሒታትን ተዛመድቲ ፕሮቲናትን ዝተኣሳሰር ምዃኑ ንእምት። እዚ ድርብ ተግባር ኤል-ኦርኒታይን ንጽልዋ ጻዕዳ ሻምብቆ ንምቅላልን ልሙዳት ኣእካል ሌጉሜን ነዚ ሓያል ፋንጋስ ረኽሲ ዘስዕብ ተጻዋርነት ንምዕባይን ዘላቒ ስትራተጂ ተስፋ ዘለዎ ሕጹይ ይገብሮ። ውጽኢት ናይዚ መጽናዕቲ፡ ጻዕዳ ሻምብቆ ንምቁጽጻርን ኣብ ምፍራይ ሌጉሜን ዘለዎ ጽልዋ ንምቅላልን ፈጠራዊ፡ ንከባቢ ዝምችእ ሜላታት ኣብ ምምዕባል ክሕግዝ ይኽእል።
ኣብዚ መፅናዕቲ ተቓላዓይ ንግዳዊ ዓይነት ልሙድ ፋጁል ጊዛ 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) ከም ፈተነ ንብረት ተጠቒሙ እዩ። ጥዑይ ዘርኢ ብሕያውነት ክፍሊ ምርምር ሌጉሜን፣ ኢንስቲትዩት ምርምር ኣእካል ሜዳ (FCRI)፣ ማእኸል ምርምር ሕርሻ (ARC)፣ ግብፂ ተዋሂቡ። ሓሙሽተ ዘርኢ ኣብ ፕላስቲክ ድስቲ (ውሽጣዊ ዲያሜትር 35 ሴንቲ ሜተር፣ ዕምቆት 50 ሴንቲ ሜትር) ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን (25 ± 2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ፣ ኣንፃራዊ ርስሓት 75 ± 1%፣ 8 ሰዓት ብርሃን/16 ሰዓት ፀልማት) ብኤስ. ድሕሪ ምዝራእ (DPS) ኣብ 7–10 መዓልታት፡ እቶም ፈልሲታት ተቐጢኖም ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ሓደ ዓይነት ዕብየት ዘለዎም ፈልሲታትን ሰለስተ ምሉእ ብምሉእ ዝተሰፍሑ ቆጽልን ጥራይ ተሪፎም። ኩሎም ኣብ ድስቲ ዝተቐመጡ ተኽልታት ኣብ ክልተ ሰሙን ሓደ ግዜ ማይ ይወሃቦምን በቲ ዝተዋህበ ዓይነት ብዝተመኸረ መጠን ወርሓዊ ድኹዒ ይወሃቦምን።
500 ሚሊግራም/ሊትር ትሕዝቶ L-ornithinediamine (ብ(+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid ዝፍለጥ፤ Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ንምድላው፡ መጀመርታ 50 ሚሊግራም ኣብ 100 ሚሊ ሊትር ጽሩይ ድስቲልድ ማይ ፈሲሱ። ብድሕሪኡ እቲ ስቶክ ፍታሕ ተቐላቒሉ ኣብ ዝቐጸለ ፈተነታት ተጠቒሙ። ብሓፂሩ ሽዱሽተ ተኸታተልቲ ትሕዝቶታት ኤል-ኦርኒታይን (12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100ን 125 ሚሊግራም/ሊትርን) ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ተፈቲኖም እዮም። ብተወሳኺ ጽሩይ ድስቲልድ ማይ ከም ኣሉታዊ ቁጽጽር (Mock) ከምኡ’ውን ንግዳዊ ጸረ-ፋንጋስ “Rizolex-T” 50% ዝረግፍ ዱቄት (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zaayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zaayat, Gharbia Governorate, Egypt) ከም ኣወንታዊ ቁጽጽር ተጠቒሙ። ንግዳዊ ጸረ ፋንጋስ “Rizolex-T” ኣብ ውሽጢ መርመራ ብሓሙሽተ ትሕዝቶ (2, 4, 6, 8 and 10 mg/L) ተፈቲኑ።
ናሙናታት ናይ ልሙዳት ጕንዲ ፋጁልን ቆጽልን ልሙድ ምልክታት ጻዕዳ ሻምብቆ (ደረጃ ወራር: 10–30%) ካብ ንግዳዊ ሕርሻታት ተኣኪቡ። መብዛሕትኦም ዝተለኽፉ ንብረታት ተኽሊ ብዓይነት/ዓይነት (ተቓላዕቲ ንግዳዊ ዓይነት ጊዛ 3) ዝተለለዩ እኳ እንተኾኑ ካልኦት ብፍላይ ድማ ካብ ዕዳጋታት ውሽጢ ዓዲ ዝተረኸቡ ዘይፍለጡ ዓይነታት እዮም። እቶም ዝተኣከቡ ዝተለኽፉ ንብረታት መጀመርያ ብ0.5% ሶድየም ሃይፖክሎራይት ፍታሕ ን3 ደቓይቕ ኣብ ላዕሊ ተፀጊዖም፣ ድሕሪኡ ብፅሩይ ድስቲልድ ማይ ብዙሕ ግዜ ተሓፂቦም ብፅሩይ ፍልተር ወረቐት ተደሪዞም ልዕሊ ዓቐን ማይ ተኣልዮም። ብድሕሪኡ እቶም ዝተለኽፉ ኣካላት ካብ ማእከላይ ቲሹ (ኣብ መንጎ ጥዑያትን ዝተለኽፉን ቲሹታት) ኣብ ንኣሽቱ ቁራጽ ተቖሪጾም፣ ኣብ ድንሽ ደክስትሮስ ኣጋር (PDA) ማእከላይ ደረጃ ተባሂሎም ኣብ 25 ± 2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ብ12 ሰዓት ብርሃን/12 ሰዓት ጸልማት ዑደት ን5 መዓልታት ተሓቢኦም ምፍጣር ስክለሮትያ ንምንቕቓሕ ተገይሩ። እቲ ማይሰልያል ቲፕ ሜላ ካብ ዝተሓዋወሰ ወይ ዝተበከለ ባህልታት ዝተነፀሉ ፋንጋስ ንምፅራይ እውን ተጠቒሙ እዩ። እቲ ዝተፀረየ ፋንጋስ ዝተነፀለ መጀመርያ ብመሰረት ባህላዊ ሞርፎሎጂ ባህርያቱ ተለልዩ ድሕሪኡ ድማ ብማይክሮስኮፒካዊ ባህርያት መሰረት ኤስ.ስክለሮቲዮረም ምዃኑ ተረጋጊፁ። ኣብ መወዳእታ ኩሎም ዝተፀረዩ ተነፀልቲ ንኮች ፖስቱላታት ንምምላእ ኣብቲ ተቓላዓይ ዝኾነ ልሙድ ፍረ ፋጁል ጊዛ 3 ንሕማም ዘስዕቡ ምዃኖም ተፈቲኖም እዮም።
ብተወሳኺ እቲ ኣዝዩ ወራሪ ዝኾነ S. sclerotiorum isolate (isolate #3) ከምቲ ብ White et al., 1990 ዝተገለፀ ኣብ ውሽጣዊ ትራንስክሪፕትድ ስፔሰር (ITS) መስርዕ መሰረት ብምግባር ብዝያዳ ተረጋጊፁ እዩ፤ Baturo-Ciesniewska et al., 2017. ብሓጺሩ፡ ዝተነጸሉ ኣብ መረቕ ድንሽ ደክስትሮስ (PDB) ተባሂሎም ኣብ 25 ± 2 °C ን5–7 መዓልታት ተሓቢኦም። ብድሕሪኡ ፋንጋስ ማይሰሊየም ተኣኪቡ ብጨርቂ በርበረ ተጣሒኑ ብጽሩይ ማይ ክልተ ግዜ ተሓጺቡ ብጽሩይ መጽረዪ ወረቐት ነቒጹ። ጂኖም ዲኤንኤ ብ Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ተጠቒምካ ተነፂሉ። ብድሕሪኡ እቲ ITS rDNA ዞባ ፍሉይ ፕራይመር ጽምዲ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ትጽቢት ዝግበረሉ ዓቐን: 540 bp) ተጠቒሙ ተዓብሊሉ ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). እቶም ዝተፀረዩ ፍርያት ፒሲኣር ንመስርዕ (Beijing Aoke Dingheng Biotechnology Co., Ltd.) ቀሪቦም እዮም። እቶም ናይ ITS rDNA መስርዕ ብናይ ሳንገር መስርዕ ኣገባብ ተጠቒሞም ብኽልተ ኣንፈት ተሰሪዖም እዮም። ብድሕሪኡ እቶም ዝተኣከቡ ቅደም ተኸተላት ሕቶታት ምስቲ ኣብ ጀንባንክን ሃገራዊ ማእከል ሓበሬታ ባዮቴክኖሎጂን (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ዝርከብ ዳሕረዋይ መረዳእታ ብብላስትን ሶፍትዌር ተጠቒሞም ተነጻጺሮም እዮም። እቲ ናይ ሕቶ ቅደም ተኸተል ምስ ካልኦት 20 S. sclerotiorum ጽግዕተኛታት/ተነጺሎም ካብ ዳሕረዋይ ዳታ ኣብ NCBI GenBank (ተመላላኢ ሰሌዳ S1) ClustalW ኣብ ሞለኪዩላዊ ፍልቀት ጀነቲክስ ትንተና ፓኬጅ (MEGA-11; ስሪት 11) (Kumar et al., 2024) ተጠቒሞም ተነጻጺሩ። ፍልቀት ትንተና ብመገዲ ዝለዓለ ተኽእሎን ሓፈሻዊ ብግዜ ዝምለስ ሞዴል ምትኽኻእ ኒውክሊዮታይድን ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ (Nei and Kumar, 2000)። እቲ ዝለዓለ ሎግ-ተኽእሎ ዘለዎ ገረብ ተገሊጹ ኣሎ። እቲ ናይ መጀመርታ ገረብ ንናይ ሂውሪስቲክ ምድላይ ኣብ መንጎ እቲ ጎረቤት-ምጽንባር (NJ) ገረብ (Kumar et al., 2024)ን እቲ ዝለዓለ ምሕረት (MP) ገረብን ዝለዓለ ሎግ-ተኽእሎ ዘለዎ ገረብ ብምምራጽ እዩ። እቲ NJ ገረብ ብሓፈሻዊ ግዜ-ዝምለስ ሞዴል ተጠቒምካ ዝተቖፀረ ብፅምዲ ርሕቀት ማትሪክስ ተጠቒምካ እዩ ተሃኒፁ (Nei and Kumar, 2000)።
ጸረ-ባክተርያ ንጥፈታት ኤል-ኦርኒታይንን ጸረ-ባክተርያ “ሪዞለክስ-ቲ”ን ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ብኣጋር ዲፍዩዥን ሜላ ተረጋጊጹ። ኣገባብ፡- ግቡእ መጠን ናይቲ ስቶክ ፍታሕ ኤል-ኦርኒታይን (500 ሚግ/ሊትር) ወሲድካ ምስ 10 ሚሊ ሊትር ናይቲ ፒዲኤ መኣዛዊ ማእከላይ ብግቡእ ብምሕዋስ ናይ መወዳእታ ትሕዝቶ 12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100ን 125 ሚሊግራም/ሊትርን ዘለዎ ፍታሕ ንምድላው። ሓሙሽተ ትሕዝቶ ናይቲ ፋንጋስ ቐታሊ “ሪዞሌክስ-ቲ” (2፣ 4፣ 6፣ 8ን 10 ሚሊግራም/ሊትርን)ን ፅሩይ ድስቲልድ ማይን ከም መቆፃፀሪ ተጠቒምና ኢና። እቲ ማእከላይ ምስ ተረረ፡ ሓድሽ ዝተዳለወ ማይሰሊያል ፕላግ ናይ ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ባህሊ፡ 4 ሚ.ሜ ዲያሜትር ዘለዎ፡ ናብ ማእከል ናይቲ ፔትሪ ዲሽ ተሰጋጊሩ፡ እቲ ማይሰሊየም ንብምሉኡ ቁጽጽር ፔትሪ ዲሽ ክሳብ ዝሽፍን ኣብ 25±2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተባሂሉ፡ ድሕሪኡ ዕብየት ፋንጋስ ተመዝጊቡ። ንመመዓራረዪ 1 ተጠቒምካ ብሚእታዊት ምዕጋት ራድያል ዕብየት S. sclerotiorum ኣስልጥ፤
እቲ ፈተነ ክልተ ግዜ ተደጋጊሙ፡ ንነፍሲ ​​ወከፍ ቁጽጽር/ፈተነ ጉጅለ ሽዱሽተ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም፡ ንነፍሲ ​​ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም ድማ ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ) ተገይሩ። ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ምድግጋም ክልተ ግዜ (ክልተ ቴክኒካዊ ምድግጋም) ተተንቲኑ፡ ንልክዕነት፡ ተኣማንነትን ምብዛሕን ውጽኢት ፈተነ ንምርግጋጽ እዩ። ብተወሳኺ፡ ፍርቂ ዝለዓለ ተዓጻጻፊ ምትእኽኻብ (IC50)ን IC99ን ንምሕሳብ ፕሮቢት ሪግረሽን ትንተና ተጠቒሙ (Prentice, 1976)።
ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን ዓቕሚ ኤል-ኦርኒታይን ንምግምጋም ክልተ ተኸታተልቲ ናይ ድስቲ ፈተነታት ተኻይዶም። ብሓጺሩ፡ ድስቲ ብዝተጻረየ ጭቃ-ሑጻ ሓመድ (3:1) ተመሊኦም ብሓድሽ ዝተዳለወ ባህሊ ኤስ. ፈለማ፡ እቲ ኣዝዩ ወራሪ ዝኾነ ዝተነጸለ ኤስ.ስክለሮቲዮረም (ተነጺሉ #3) ሓደ ስክለሮቲየም ኣብ ክልተ ብምቑራጽ፡ ገጹ ንታሕቲ ኣብ ፒዲኤ ብምቕማጥን ኣብ 25 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ኣብ ቀጻሊ ጸልማት (24 ሰዓት) ን4 መዓልታት ብምሕቃቕን ዕብየት ማይሰሊያል ብምንቕቓሕ ባህሊ ተገይሩሉ። ብድሕሪኡ ኣርባዕተ 5 ሚ.ሜ ዲያሜትር ዘለዎም ኣጋር ፕላግስ ካብቲ መሪሕ ጫፍ ተወሰዱ ብ100 ግ ጽሩይ ምትሕውዋስ ስርናይን ሩዝን ብራን (1:1, v/v) ተኸቲቦም ኩሎም ፍላስካታት ኣብ 25 ± 2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ኣብ ትሕቲ 12 ሰዓት ብርሃን/12 ሰዓት ጸልማት ዑደት ን5 መዓልታት ተሓቢኦም ምፍጣር ስክለሮትያ ንምንቕቓሕ ተገይሩ። ትሕዝቶ ናይ ኩሎም ፍላስካታት ቅድሚ ሓመድ ምውሳኽ ሓደ ዓይነት ምዃኑ ንምርግጋጽ ብግቡእ ተሓዋዊሱ። ብድሕሪኡ፡ ቀጻሊ ምትእኽኻብ ረኽሲታት ንምርግጋጽ፡ 100 ግ ናይቲ መግዛእቲ ዝገብር ምትሕውዋስ ብራን ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ተወሰኸ። እቶም ዝተኸተቡ ድስቲ ዕብየት ፋንጋስ ንምንቅስቓስ ማይ ተዋሂብዎም ኣብ ኩነታት ጀሪካን ን7 መዓልታት ተቐሚጦም።
ብድሕሪኡ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ሓሙሽተ ዘርኢ ናይቲ ጊዛ 3 ዓይነት ተዘሪኡ። ብኤል-ኦርኒታይንን ፋንጋስ ቐታሊ ሪዞሌክስ-ቲን ዝተሓከሙ ድስቲ፡ እቶም ዝተጻረዩ ዘርኢ መጀመርያ ኣብ ማይ ፍታሕ ናይቶም ክልተ ውህደታት ብናይ መወዳእታ IC99 ትሕዝቶ ኣስታት 250 ሚሊግራም/ሊትርን 50 ሚሊግራም/ሊትርን ንኽልተ ሰዓታት ተጠሊቖም፡ ድሕሪኡ ቅድሚ ምዝራኦም ንሓደ ሰዓት ብኣየር ነቒጾም። ብኻልእ ወገን ድማ እቶም ዘርኢ ከም ኣሉታዊ ቁፅፅር ኣብ ፅሩይ ድስቲልድ ማይ ተጠሊቖም እዮም። ድሕሪ 10 መዓልቲ ቅድሚ ናይ መጀመርታ ማይ ምሃብ እቶም ፈልሲታት ተቐጢኖም ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ጽፉፋት ፈልሲታት ጥራይ ተሪፎም። ብተወሳኺ ብኤስ.ስክለሮቲዮረም ረኽሲ ንምርግጋፅ ኣብ ተመሳሳሊ ደረጃ ምዕባለ (10 መዓልቲ) ንዘሎ ጕንዲ ተኽሊ ፋቱላ ኣብ ክልተ ዝተፈላለዩ ቦታታት ብዝተፀረየ ስካለፐል ተቖሪፁ ኣስታት 0.5 ግ ካብቲ መግዛእቲ ዝገብር ምትሕውዋስ ብራን ኣብ ነፍሲ ወከፍ ቁስሊ ተቐሚጡ፣ ድሕሪኡ ልዑል ርስሓት ተገይሩሉ ኣብ ኩሎም ዝተኸተቡ ተኽልታት ረኽስን ምዕባለ ሕማምን ንምንቕቓሕ ተገይሩ። መቆጻጸሪ ተኽልታት ብተመሳሳሊ ቆሲሎም ማዕረ መጠን (0.5 ግ) ጽሩይ፣ ዘይተገዝአ ምትሕውዋስ ብራን ኣብቲ ቁስሊ ተቐሚጡ ኣብ ትሕቲ ልዑል ርስሓት ተዓቂቡ ንዕቤት ሕማም ከባቢ ንምምሳልን ኣብ መንጎ ጉጅለታት ሕክምና ቅኑዕነት ንምርግጋጽን ተገይሩ።
ኣገባብ ምሕካም፦ ፈልሲታት ፋቱላ ብ500 ሚሊ ሊትር ማይ ዝሓዘ ፍታሕ ኤል-ኦርኒታይን (250 ሚሊግራም/ሊትር) ወይ ድማ ፋንጋስ ፀረድ ሪዞሌክስ-ቲ (50 ሚሊግራም/ሊትር) ብሓመድ ብምስኖ ማይ ተዋሂብዎም፣ ድሕሪኡ እቲ ምሕካም ኣብ ፍልልይ 10 መዓልቲ ሰለስተ ግዜ ተደጊሙ። እቶም ብፕላስቦ ዝተሓከሙ ቁጽጽር ዝገበሩ ሰባት ብ500 ሚሊ ሊትር ጽሩይ ድስቲልድ ማይ መስኖ ተዋሂብዎም። ኩሎም ፍወሳታት ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን (25 ± 2°C፣ 75 ± 1% ኣንጻራዊ ርስሓት፣ ከምኡ’ውን ፎቶፔሪዮድ 8 ሰዓት ብርሃን/16 ሰዓት ጸልማት) ተኻይዶም። ኩሎም ድስቲ ኣብ ክልተ ሰሙን ማይ ተዋሂብዎምን ብመሰረት እቲ ንፍሉይ ዓይነትን መምርሒታት ኣፍራዪን ዝወሃብ ለበዋታትን ብመምርሒታት ኣፍራዪን ብዝተመጣጠነ NPK ድኹዒ (20-20-20፣ ምስ 3.6% ሳልፈርን TE ማይክሮኤለመንትን፤ ዛይን ዘርኢ፣ ግብፂ) ብ3–4 ግ/ሊትር ትሕዝቶ ብፎሊየር ስፕራይንግ ተሓኪሞም። ካልእ እንተዘይተገሊጹ፡ ምሉእ ብምሉእ ዝተዘርግሑ ብሱላት ቆጽሊ (2ይን 3ይን ቆጽሊ ካብ ላዕሊ) ካብ ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ረፕሊኬት ኣብ 72 ሰዓት ድሕሪ ሕክምና (hpt) ተኣኪቡ፡ ንተወሳኺ ትንተናታት ሓዊሱ፡ ግን ከኣ ኣብዚ ጥራይ ዘይተሓጽረ፡ ኣብ ቦታ ሂስቶኬሚካላዊ ምምቕቓል ኦክሲዳቲቭ ጸቕጢ መርኣይታት፡ ሽኮር ፐሮክሳይድ፡ ኢንዛይማቲክን ዘይ-ኢንዛይማቲክን ሓዊሱ፡ ሓደ ዓይነት፡ ተኣኪቡን ኣብ -80 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተዓቂቡን። ጸረ-ኦክስጅንን መግለጺ ጂንን ምዃኑ’ዩ።
ጽዓት ረኽሲ ጻዕዳ ሻምብቆ ድሕሪ ምኽታብ ኣብ ሰሙናዊ 21 መዓልታት (dpi) ብተራንን ካልኦትን ዝተቐየረ ፔትዞልድን ዲክሰንን ስኬል (1996) መሰረት ብምግባር ካብ 1–9 ዝበጽሕ ስኬል (ተመላላኢ ሰሌዳ S2) ተጠቒምካ ተገምጊሙ። (2006) ዝብል ጽሑፍ ኣቕሪቡ። ብሓፂሩ ኣብ ኢንተርኖድስን ኖድስን ዝረአ ምዕባለ ቁስሊ ንምክትታል ካብቲ ዝተኸተበሉ ቦታ ጀሚሩ ጉንዲን ጨናፍርን ተኽሊ ፋቱላ ተፈቲሹ። ብድሕሪኡ ርሕቀት ናይቲ ቁስሊ ካብቲ ዝተኸተበሉ ቦታ ክሳብ እቲ ዝረሓቐ ነጥቢ ኣብ ጎኒ ጕንዲ ወይ ጨንፈር ተለኪዑ፡ ብመሰረት ኣቀማምጣ እቲ ቁስሊ 1–9 ነጥቢ ተመዲቡ፡ ኣብዚ (1) ኣብ ጥቓ እቲ ዝተኸተበሉ ነጥቢ ዝርአ ረኽሲ ከምዘየለ ዘመልክት ኮይኑ፡ (2–9) ድማ ቀስ ብቐስ ስፍሓት ቁስሊን ምዕባለን ኣብ ጎኒ ኖድስ/ኢንተርኖድስ ከምዘመልክት (ተመላላኢ ሰሌዳ S2)። ብድሕሪኡ ጽዓት ረኽሲ ጻዕዳ ሻምብቆ ቀመር 2 ተጠቒሙ ናብ ሚእታዊት ተቐይሩ፤
ብተወሳኺ ኣብ ትሕቲ እቲ ሕማም ምዕባለ መስመር (AUDPC) ዘሎ ስፍሓት ብቐመር (Shaner and Finney, 1977) ተጠቒምካ ተሰሊዑ፣ እዚ ድማ ኣብ ቀረባ እዋን ንጻዕዳ ምብስባስ ናይ ልሙድ ፋጁል (Chauhan et al., 2020) ንመመዓራረዪ 3 ተጠቒሙ ዝተመጣጠነ እዩ፤
ኣብዚ Yi = ጽንኩርነት ሕማም ኣብ ግዜ ti፣ Yi+1 = ጽንኩርነት ሕማም ኣብ ዝቕጽል ግዜ ti+1፣ ti = ናይ መጀመርታ ምዕቃን ግዜ (ብመዓልቲ)፣ ti+1 = ዝቕጽል ምዕቃን ግዜ (ብመዓልቲ)፣ n = ጠቕላላ ቁጽሪ ናይ ግዜ ነጥብታት ወይ ናይ ትዕዝብቲ ነጥብታት። ቁመት ተኽሊ (ሴንቲ ሜትር)፣ ብዝሒ ጨናፍር ኣብ ሓደ ተኽሊ፣ ብዝሒ ቆፅሊ ኣብ ሓደ ተኽሊ ሓዊሱ መለክዒታት ዕብየት ተኽሊ ፋቱላ ኣብ ኩሎም ስነ-ህይወታዊ ምድግጋማት ን21 መዓልታት ሰሙናዊ ተመዝጊቦም እዮም።
ኣብ ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም፡ ናሙናታት ቆጽሊ (ካብ ላዕሊ ካልኣይን ሳልሳይን ምሉእ ብምሉእ ዝማዕበሉ ቆጽሊ) ድሕሪ ሕክምና ኣብ መዓልቲ 45 (ድሕሪ ናይ መወዳእታ ሕክምና 15 መዓልታት) ተኣኪቡ። ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምብዛሕ ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ) ዝሓዘ እዩ ነይሩ። ካብቲ ዝተጨፍለቐ ቲሹ ኣስታት 500 ሚሊግራም ኣብ ጸልማት 80% ኣሲቶን ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተጠቒምካ ፎቶሲንተቲክ ቀለም (ክሎሮፊል ኤ፣ ክሎሮፊል ቢን ካሮቲኖይድን) ንምውጻእ ተጠቒሙ። ድሕሪ 24 ሰዓት እቶም ናሙናታት ብሴንትሪፉጅ ተገይሮም እቲ ልዕሊ ማይ ንውሳነ ትሕዝቶ ክሎሮፊል a፣ ክሎሮፊል bን ካሮቲኖይድን ብመሰረት ኣገባብ (Lichtenthaler, 1987) ኣብ ሰለስተ ዝተፈላለዩ ንውሓት ማዕበል ብምዕቃን UV-160A ስፔክትሮፎቶሜተር (Shimadzu Corporation, Japan) ተጠቒምካ ብኮሎሪሜትሪክ ተኣኪቡ። (A470, A646 ከምኡ’ውን A663 ና.ሜ)። ኣብ መወዳእታ፡ ትሕዝቶ ፎቶሲንተቲክ ቀለም ነዞም ዝስዕቡ ብሊክተንታለር (1987) ዝተገልጹ ቀመማት 4–6 ተጠቒምካ ተሰሊዑ።
ኣብ 72 ሰዓት ድሕሪ ሕክምና (hpt)፡ ቆጽሊ (ካልኣይን ሳልሳይን ምሉእ ብምሉእ ዝማዕበሉ ቆጽሊ ካብ ላዕሊ) ካብ ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ረፕሊኬት ንin situ histochemical localization of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2•−) ተኣኪቡ። ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምብዛሕ ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ) ዝሓዘ እዩ ነይሩ። ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም ብተደጋጋሚ (ክልተ ቴክኒካዊ ምድግጋም) ተተንቲኑ ልክዕነት፣ ተኣማንነትን ምብዛሕን እቲ ኣገባብ ንምርግጋፅ እዩ። H2O2ን O2•−ን ብቕደም ተኸተል ብ Romero-Puertas et al. (2004) ከምኡ’ውን ኣዳምን ካልኦትን. (1989) ምስ ንኣሽቱ ምምሕያሻት። ንሂስቶኬሚካላዊ ምምቕቓል H2O2 ኣብ ቦታኡ፡ ፍረታት ብ0.1% DAB ኣብ 10 ሚሊ ሜተር ትሪስ መከላኸሊ (pH 7.8) ብባዶ ቦታ ተሰሊፎም ድሕሪኡ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ኣብ ብርሃን ን60 ደቓይቕ ተሓቢኦም። ጽሑፋት ብ0.15% (v/v) TCA ኣብ 4:1 (v/v) ኤታኖል:ክሎሮፎርም (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ተበሊሖም ድሕሪኡ ክሳብ ዝጸልመቱ ንብርሃን ተቓሊዖም። ብተመሳሳሊ ቫልቭታት ብ10 ሚሊ ሜትር ፖታስየም ፎስፌት መከላኸሊ (pH 7.8) 0.1 w/v % HBT ዝሓዘ ንሂስቶኬሚካላዊ ምምቕቓል O2•− ኣብ ቦታኡ ብቫክዩም ተሰሊፎም። እቶም ጽሑፋት ኣብ ብርሃን ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን20 ደቓይቕ ተሓቢኦም፡ ድሕሪኡ ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ ተበሊሖም፡ ድሕሪኡ ጸሊም ሰማያዊ/ቫዮሌት ነጠብጣባት ክሳብ ዝረኣዩ ተበርሁ። ጽዓት ናይቲ ውጽኢት ዝኾነ ቡናዊ (ከም H2O2 መርኣዪ) ወይ ሰማያዊ-ቫዮሌት (ከም O2•− መርኣዪ) ሕብሪ ፊጂ ስሪት ናይቲ ምስሊ መስርሕ ፓኬጅ ImageJ (http://fiji.sc; 7 መጋቢት 2024 ዝተረኽበ) ተጠቒሙ ተገምጊሙ።
ማሎንዲያልደሃይድ (MDA; ከም ምልክት ሽኮር ፐሮክሳይድ) ብመሰረት ኣገባብ ዱን ብራምላጅን (1992) ብንእሽቶ ምምሕያሻት ተገይሩሉ። ካብ ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ምብዛሕ ቆጽሊ (ካልኣይን ሳልሳይን ምሉእ ብምሉእ ዝማዕበሉ ቆጽሊ ካብ ላዕሊ) ድሕሪ 72 ሰዓታት ድሕሪ ሕክምና (hpt) ተኣኪቡ። ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ምብዛሕ ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ) ዘጠቓለለ እዩ። ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም ብተደጋጋሚ (ክልተ ቴክኒካዊ ምድግጋም) ተተንቲኑ ልክዕነት፣ ተኣማንነትን ምብዛሕን እቲ ኣገባብ ንምርግጋፅ እዩ። ብሓፂሩ 0.5 ግ ዝተመጠጠ ቲሹ ቆፅሊ ንኤምዲኤ ምውጻእ ብ20% ትራይክሎሮኣሲቲክ ኣሲድ (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) 0.01% ቡቲለይትድ ሃይድሮክሲቶሉይን (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ዝሓዘ ተጠቒሙ። ብድሕሪኡ ኣብቲ ልዕሊ ማይ ዝነበረ ትሕዝቶ MDA ብUV-160A ስፔክትሮፎቶሜተር (Shimadzu Corporation, Japan) ተጠቒምካ ኣብ 532ን 600ን ና.ሜ ዘሎ ምምጥጣን ብምዕቃን ብኮሎሪሜትሪክ ተረጋጊፁ ድሕሪኡ ብnmol g−1 FW ተገሊፁ።
ንመገምገሚ ዘይኢንዛይማውን ኢንዛይማውን ጸረ-ኦክስጅን፡ ቆጽሊ (ካልኣይን ሳልሳይን ምሉእ ብምሉእ ዝማዕበለ ቆጽሊ ካብ ላዕሊ) ካብ ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ምብዛሕ ኣብ 72 ሰዓታት ድሕሪ ሕክምና (hpt) ተኣኪቡ። ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምብዛሕ ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ) ዝሓዘ እዩ ነይሩ። ነፍሲ ወከፍ ባዮሎጂካዊ ናሙና ብተደጋጋሚ (ክልተ ቴክኒካዊ ናሙናታት) ተተንቲኑ። ክልተ ቆጽሊ ብፈሳሲ ናይትሮጅን ተፈቲሑ ብቐጥታ ንኢንዛይማዊን ዘይኢንዛይማዊን ጸረ-ኦክስጅን፣ ጠቕላላ ኣሚኖ ኣሲድ፣ ትሕዝቶ ፕሮሊን፣ መግለጺ ጂንን ንብዝሒ ኦክሳሌትን ተጠቒሞም።
ጠቕላላ ዝፈስሱ ፊኖሊክስ ብFolin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ተጠቒምካ ምስቲ ብKahkonen et al. (1999) ዝብል ጽሑፍ ኣቕሪቡ። ብሓፂሩ ኣስታት 0.1 ግ ሆሞጀናይዝድ ቲሹ ቆፅሊ ብ20 ሚሊ ሊትር 80% ሜታኖል ኣብ ፀልማት ን24 ሰዓት ተቐዲሑ እቲ ልዕሊ ማይ ድሕሪ ሴንትሪፉጌሽን ተኣኪቡ። 0.1 ሚሊ ሊትር ናይቲ ናሙና ቅብኣት ምስ 0.5 ሚሊ ሊትር ፎሊን-ሲዮካልተው ሪኣጀንት (10%) ተሓዋዊሱ ን30 s ተናዊጹ ን5 ደቓይቕ ኣብ ጸልማት ተገዲፉ። ብድሕሪኡ 0.5 ሚሊ ሊትር 20% ሶድየም ካርቦኔት ፍታሕ (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ኣብ ነፍሲ ወከፍ ቱቦ ተወሰኸሉ፣ ብግቡእ ተሓዋዊሱ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ኣብ ጸልማት ን1 ሰዓት ተሓቢኡ። ድሕሪ ምሕቃቕ፡ ምምጣጥ ናይቲ ምትሕውዋስ ምላሽ ኣብ 765 ና.ሜ ብUV-160A ስፔክትሮፎቶሜተር (Shimadzu Corporation, Japan) ተጠቒምካ ተለኪዑ። ኣብቲ ናሙና ቅብኣታት ዝርከቡ ጠቕላላ ዝፈስሱ ፊኖላት ብጋሊክ ኣሲድ ምዕቃን መስመር (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ተጠቒምካ ዝተወሰነ ኮይኑ ብሚሊግራም ማዕረ ጋሊክ ኣሲድ ኣብ ሓደ ግራም ፍሩይ ክብደት (mg GAE g-1 fresh weight) ተገሊጹ።
ጠቕላላ ትሕዝቶ ዝፈስስ ፍላቮኖይድ ብመሰረት ኣገባብ Djeridane et al. (2006) ቁሩብ ምምሕያሻት ብምግባር። ብሓጺሩ 0.3 ሚሊ ሊትር ካብዚ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ ሜታኖል ቅብኣት ምስ 0.3 ሚሊ ሊትር 5% ኣሉሚንየም ክሎራይድ ፍታሕ (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ተሓዋዊሱ፡ ብሓይሊ ተነቓኒቑ ድሕሪኡ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን5 ደቓይቕ ተሓቢኡ፡ ድሕሪኡ 0.3 ሚሊ ሊትር 10% ፖታስየም ኣሴቴት ፍታሕ (Al-Gomhoria) ተወሰኸሉ። ፋርማሲቲካልስን ሕክምናዊ ኣቕሑን፡ ካይሮ፡ ግብጺ)፡ ብግቡእ ተሓዋዊሶም ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን30 ደቓይቕ ኣብ ጸልማት ተሓቢኦም። ድሕሪ ምሕቃቕ፡ ምምጣጥ ናይቲ ምትሕውዋስ ምላሽ ኣብ 430 ና.ሜ ብUV-160A ስፔክትሮፎቶሜተር (Shimadzu Corporation, Japan) ተለኪዑ። ምትእኽኻብ ጠቕላላ ዝፈስሱ ፍላቮኖይድስ ኣብ ናሙና ቅብኣታት ሩቲን ምዕቃን መስመር (TCI America, Portland, OR, USA) ተጠቒምካ ተረጋጊጹ ድሕሪኡ ብሚሊግራም ሩቲን ማዕረ ኣብ ሓደ ግራም ፍሩይ ክብደት (mg RE g-1 ፍሩይ ክብደት) ተገሊጹ።
ጠቕላላ ትሕዝቶ ነፃ ኣሚኖ ኣሲድ ቆፅሊ ፋጁል ብዮኮያማን ሂራማትሱን (2003) ብዝተሓሰበ ኣገባብ መሰረት ብዝተመሓየሸ ኒንሃይድሪን ሪኣጀንት (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ተጠቒምካ እዩ ተረጋጊፁ። (2006) ዝብል ጽሑፍ ኣቕሪቡ። ብሓጺሩ 0.1 ግ ዝተመጠጠ ቲሹ ብ pH 5.4 መከላኸሊ ተቐዲሑ፡ 200 μL ናይቲ ልዕሊ ማይ ምስ 200 μL ኒንሃይድሪን (2%)ን 200 μL ፒሪዲንን (10%፤ Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) ርክብ ተገይሩሉ፡ ኣብ ዝፈልሐ ማይ መሕጸቢ ን30 ደቓይቕ ተሓቢኡ፡ ድሕሪኡ ዝዘሓለን ኣብ... 580 ና.ሜ ብUV-160A ስፔክትሮፎቶሜተር (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን ጃፓን) ተጠቒምካ። ብኻልእ ወገን ድማ ፕሮሊን ብመገዲ ባተስ እዩ ተረጋጊፁ (Bates et al., 1973)። ፕሮሊን ብ3% ሳልፎሳሊሲሊክ ኣሲድ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ተቐዲሑ ድሕሪ ሴንትሪፉጌሽን ድማ 0.5 ሚሊ ሊትር ካብቲ ልዕሊ ማይ ዝነበረ ማይ ምስ 1 ሚሊ ሊትር ግላስያል ኣሲቲክ ኣሲድ (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)ን ኒንሃይድሪን ሪኣጀንት ተሓዋዊሱ ኣብ 90 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን45 ደቓይቕ ተሓዊሱ ዝዘሓለን ኣብ ተዓቂኑን። 520 ና.ሜ ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ ስፔክትሮፎቶሜተር ብምጥቃም። ጠቕላላ ነጻ ኣሚኖ ኣሲዳትን ፕሮሊንን ኣብ ቆጽሊ ቅብኣታት ብቕደም ተኸተል ግላይሲንን ፕሮሊንን ምዕቃን ተርባጽ (ሲግማ-ኣልድሪች፡ ሴንት ሉዊስ፡ MO, USA) ተጠቒምካ ተረጋጊጹ፡ ብሚግ/ግ ፍሩይ ክብደት ድማ ተገሊጹ።
ንጥፈት ኢንዛይም ጸረ-ኦክስጅን ኢንዛይማት ንምፍላጥ፡ ኣስታት 500 ሚሊግራም ሓደ ዓይነት ቲሹ ብ3 ሚሊ ሊትር 50 ሚሊ ሜትር ትሪስ ባፈር (pH 7.8) 1 ሚሊ ሜተር EDTA-Na2 (ሲግማ-ኣልድሪች፡ ሴንት ሉዊስ፡ MO, USA)ን 7.5% ፖሊቪኒልፒሮሊዶንን (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ኣብ 10,000 × g ን20 ደቓይቕ ኣብ ትሕቲ መዝሓሊ (4 °C) ሴንትሪፉጅ ተገይሩ፣ እቲ ልዕሊ ማይ (crude enzyme extract) ድማ ተኣኪቡ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)። ብድሕሪኡ ካታላዝ (CAT) ምስ 2 ሚሊ ሊትር 0.1 M ሶድየም ፎስፌት መከላኸሊ (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)ን 100 μl 269 mM H2O2 ፍታሕን ብምትሕብባር ብመሰረት ኣገባብ Aebi (1984) ብንእሽቶ ምምሕያሻት (El-Nagar et al., 2023; ዑስማንን ካልኦትን፡ 2023)። ኣብ ጓያኮል ዝምርኮስ ፐሮክሳይድ (POX) ኢንዛይማዊ ንጥፈታት ብመገዲ ሃራችን ካልኦትን ተጠቒምካ እዩ ተረጋጊጹ። (2009) ዝብል ጽሑፍ ኣቕሪቡ። (2008) ምስ ንኣሽቱ ምምሕያሻት (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ከምኡ’ውን ኢንዛይማዊ ንጥፈት ፖሊፊኖል ኦክሳይድ (PPO) ድሕሪ ርክብ ምስ 2.2 ሚሊ ሊትር 100 ሚሊ ሊትር ሶድየም ፎስፌት መከላኸሊ (pH 6.0)፣ 100 μl ጓያኮል (TCI chemicals, Portland, OR, USA) ከምኡ’ውን 100 μl 12 mM H2O2። እቲ ኣገባብ ካብ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ቁሩብ ተቐይሩ። እቲ መርመራ ድሕሪ ርክብ ምስ 3 ሚሊ ሊትር ካቴኮል ፍታሕ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ኣብ 0.1 M ፎስፌት መከላኸሊ (pH 6.0) ሓድሽ ዝተዳለወ እዩ ተኻይዱ። ንጥፈት CAT ኣብ 240 ና.ሜ (A240) ምብስባስ H2O2 ብምክትታል ተለኪዑ፣ ንጥፈት POX ኣብ 436 ና.ሜ (A436) ወሰኽ ምምጥጣን ብምክትታል ተለኪዑ፣ ንጥፈት PPO ድማ ኣብ ነፍሲ ወከፍ 30 s ን3 ደቓይቕ UV-160A ተጠቒምካ ናይ ምምጣጥ ምልውዋጥ ብምምዝጋብ ተለኪዑ ስፔክትሮፎቶሜተር (ሺማድዙ፡ ጃፓን)።
ንደረጃ ትራንስክሪፕት ሰለስተ ምስ ጸረ-ኦክስጅን ዝተኣሳሰሩ ጂናት ንምፍላጥ ተጠቒሙ፡ ንሳቶም ድማ ፐሮክሲሶማል ካታለዝ (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1)፡ ሱፐርኦክሳይድ ዲስሙተዝ (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1)፡ ከምኡ’ውን ግሉታቲዮን ሪዱክተዝ (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1)፣ ኣብ ቆፅሊ ፋጁል (ካብ ላዕሊ ካልኣይን ሳልሳይን ምሉእ ብምሉእ ዝማዕበለ ቆፅሊ) ድሕሪ ናይ መወዳእታ ሕክምና 72 ሰዓት። ብሓፂሩ RNA ብመሰረት ፕሮቶኮል ኣፍራዪ Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) ተጠቒምካ ተነፂሉ። ብድሕሪኡ ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit ተጠቒምካ cDNA ተሰሪሑ። ናይዞም ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሱ ሰለስተ ጂናት ፕራይመር መስርዕ ኣብ ተወሳኺ ሰሌዳ S3 ተዘርዚሮም ኣለዉ። PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ከም ናይ ገዛ ምሕላው ጂን ተጠቒሙ እቲ ተዛማዲ ጂን መግለጺ ድማ ብ2-ΔΔCT ሜላ ተጠቒምካ ተሰሊዑ (Livak and Schmittgen, 2001)። ምርግጋእ ኣክቲን ኣብ ትሕቲ ባዮቲክ ጸቕጢ (ኣብ መንጎ ልሙዳት ፍረታት ጣፍን ኣንትራክኖስ ፋንጋስን Colletotrichum lindemuthianum ዘይቃዶ ምትእስሳር) ከምኡ’ውን ኣቢዮቲክ ጸቕጢ (ድርቂ፡ ጨውነት፡ ትሑት ሙቐት) ተራእዩ (Borges et al., 2012)።
ኣብ መጀመርታ ብፕሮቲን-ፕሮቲን BLAST መሳርሒ (BLASTp 2.15.0+) ብምጥቃም ናይ oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) ፕሮቲናት ኣብ S. sclerotiorum ጂኖም-ዓቐን ኣብ ሲሊኮ ትንተና ኣካይድና (Altschul et al., 1997, 2005)። ብሓፂሩ ካብ Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) ከምኡ እውን Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number) OAH ተጠቒምና ኢና። XP_056833920.1፤316 ኣሚኖ ኣሲዳት) ከም ሕቶ መስርዕ ነቲ ኣብ ኤስ. BLASTp ኣንጻር እቲ ኣብ ቀረባ እዋን ኣብ GenBank ኣብ መርበብ ሓበሬታ ሃገራዊ ማእከል ሓበሬታ ባዮቴክኖሎጂ (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ዝተረኸበ መረዳእታ ጂኖም S. sclerotiorum እዩ ተኻይዱ።
ብተወሳኺ፡ እቲ ዝተገመተ OAH ጂን ካብ S. sclerotiorum (SsOAH) ከምኡ’ውን ፍልቀት ትንተናን ፋይሎጀነቲካዊ ገረብ AfOAH ካብ A. fijiensis CBS 313.89ን PlOAH ካብ P. lagenaን ኣብ MEGA11 (Tamura et al., 2021) ከምኡ’ውን ኣብ JTT matrix-based model (Jones et al., 1992) ዝብል ጽሑፍ ኣሎ። እቲ ፋይሎጀነቲካዊ ገረብ ምስ ብዙሕ ኣሰላልፋ ትንተና ፕሮቲን መስርዕ ናይ ኩሎም ዝተገመቱ OAH ጂናት (SsOAH) ካብ S. sclerotiorumን ሕቶ መስርዕን ብመገዲ Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007 ዓ.ም.ፈ.)። ብተወሳኺ፡ እቶም ዝበለጹ ዝሰማምዑ ኣሚኖ ኣሲድ መስርዕ SsOAH ካብ S. sclerotiorum ምስ ናይ ሕቶ መስርዕ (AfOAH and PlOAH) (Larkin et al., 2007) ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ተጠቒሞም ተሰሪዖም፡ ኣብቲ ኣሰላልፋ ዝተዓቀቡ ዞባታት ድማ ብመሳርሒ ESPript (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/ኢንዴክስ.php) ዝብል ጽሑፍ ኣሎ።
ካብዚ ብተወሳኺ፡ እቶም ዝተገመቱ ተግባራዊ ውክልና ዓውድታትን ዝተዓቀቡ ቦታታትን S. sclerotiorum SsOAH፡ ብመሳርሒ InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ተጠቒሞም ኣብ ዝተፈላለዩ ስድራቤታት ብመተሓባበሪ መንገዲ ተመዲቦም (Blum et al., 2021)። ኣብ መወዳእታ፡ ሰለስተ-መኣዝናዊ (3D) ቅርጺ ሞዴሊንግ ናይቲ ዝተገመተ S. sclerotiorum SsOAH ብፕሮቲን ሆሞሎጂ/ኣናሎጂ ኣፍልጦ ሞተር (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ተጠቒምካ ተኻይዱን ተጠቒሙ ድማ ተረጋጊጹን። እቲ SWISS-MODEL ዝበሃል ኣገልጋሊ (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014)። እቶም ዝተገመቱ ሰለስተ-መኣዝናዊ ኣቃውማታት (PDB format) ብመተሓባበሪ መንገዲ ብUCSF-Chimera package (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) ተጠቒሞም ተራእዮም (Pettersen et al., 2004)።
ኣብ ማይሴልያ ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ዝርከብ ደረጃ ትራንስክሪፕሽናል ኦክሳሎኣሴቴት ኣሲታይልሃይድሮለዝ (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) ንምፍላጥ ብዝሒ ሓቀኛ ግዜ ፍሎረሰንስ ፒሲኣር ተጠቒሙ። ብሓጺሩ፡ S. sclerotiorum ኣብ PDB ዝሓዘ ፍላስካ ተኸቲቡ ኣብ ዝንቀሳቐስ ኢንኪቤተር (ሞዴል: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ኣብ 25 ± 2 °C ን24 ሰዓታት ኣብ 150 rpmን ኣብ ቀጻሊ ጸልማት (24 ሰዓት)ን ተቐሚጡ ዕብየት ማይሰልያ ንምንቕቓሕ ተገይሩ። ብድሕሪኡ፡ እቶም ዋህዮታት ብL-ornithineን ፋንጋስ ቐታሊ Rizolex-Tን ኣብ ናይ መወዳእታ IC50 ትሕዝቶ (ኣስታት 40ን 3.2 ሚግ/ሊትርን፡ ብቕደም ተኸተል) ተሓኪሞም፡ ድሕሪኡ ንተወሳኺ 24 ሰዓታት ኣብ ተመሳሳሊ ኩነታት ተባሂሎም። ድሕሪ ምሕቃቕ፡ እቶም ባህልታት ብ2500 rpm ን5 ደቓይቕ ብሴንትሪፉጅ ተገይሮም፡ እቲ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ (ፋንጋስ ማይሰሊየም) ድማ ንትንተና መግለጺ ጂን ተኣኪቡ። ብተመሳሳሊ መንገዲ ፋንጋስ ማይሰሊየም ኣብ 0፣ 24፣ 48፣ 72፣ 96ን 120 ሰዓትን ድሕሪ ረኽሲ ካብ ዝተለኸፉ ተኽልታት ኣብ ልዕሊ እቶም ዝተለኸፉ ቲሹታት ጻዕዳ ሻምብቆን ጡጥ ማይሰሊየምን ዝፈጠሩ ተኣኪቡ እዩ። ካብቲ ፋንጋስ ማይሰሊየም RNA ተቐዲሑ ድሕሪኡ ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ cDNA ተሰሪሑ። ንSsOAH ዝኸውን ፕራይመር መስርዕ ኣብ ተወሳኺ ሰሌዳ S3 ተዘርዚሩ ኣሎ። SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) ከም ናይ ገዛ ምሕደራ ጂን ተጠቒሙ፣ ኣንጻራዊ ጂን መግለጺ ድማ ብ2-ΔΔCT ሜላ ተጠቒምካ ተሰሊዑ (Livak and Schmittgen, 2001)።
ኦክሳሊክ ኣሲድ ኣብ መረቕ ድንሽ ደክስትሮስ (PDB)ን ፋንጋስ ረኽሲ ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ኣብ ዝሓዙ ናሙናታት ተኽልን ብመሰረት ኣገባብ ዙን ዣንግን (2000) ቁሩብ ምምሕያሽ ብምግባር ተረጋጊፁ እዩ። ብሓጺሩ፡ S. sclerotiorum ዝተነጸሉ ኣብ PDB ዝሓዙ ፍላስካታት ተኸቲቦም ድሕሪኡ ኣብ ዝንቀሳቐስ ኢንኪቤተር (ሞዴል I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ብ150 rpm ኣብ 25 ± 2 °C ን3-5 መዓልታት ኣብ ቀጻሊ ጸልማት (24 ሰዓት) ንዕብየት ማይሰልያ ንምንቕቓሕ ተባሂሎም። ድሕሪ ምሕቃቕ፡ እቲ ባህሊ ፋንጋስ መጀመርታ ብዋትማን #1 ፍልተር ወረቐት ተጻሪዩ ድሕሪኡ ብ2500 rpm ን5 ደቓይቕ ሴንትሪፉጅ ተገይሩ ተረፍ ማይሰሊየም ተኣልዩ። እቲ ኣብ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ተኣኪቡ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተዓቂቡ ንተወሳኺ ብዝሒ ምውሳን ኦክሳሌት ተገይሩ። ንምድላው ናሙናታት ተኽሊ፡ ኣስታት 0.1 ግ ቁርጽራጽ ቲሹ ተኽሊ ሰለስተ ግዜ ብድስቲልድ ማይ (2 ሚሊ ሊትር ኣብ ነፍሲ ወከፍ ግዜ) ተቐዲሑ። ብድሕሪኡ እቶም ናሙናታት ብ2500 rpm ን5 ደቓይቕ ሴንትሪፉጅ ተገይሮም፣ እቲ ልዕሊ ማይ ብደረቕ ብዋትማን ቁፅሪ 1 ፍልተር ወረቐት ተፃሪዩ ንተወሳኺ ትንተና ተኣኪቡ።
ንብዝሒ ትንተና ኦክሳሊክ ኣሲድ፡ እቲ ምትሕውዋስ ምላሽ ኣብ ብርጭቆ ዝተዓጽወ ቱቦ ብኸምዚ ዝስዕብ ቅደም ተኸተል ተዳልዩ፡ 0.2 ሚሊ ሊትር ናሙና (ወይ ፒዲቢ ባህሊ ፍልትሬት ወይ ኦክሳሊክ ኣሲድ ስታንዳርድ ፍታሕ)፡ 0.11 ሚሊ ሊትር ብሮሞፊኖል ሰማያዊ (BPB, 1 ሚሊ ሜተር፤ ፊሸር ኬሚካል፡ ፒትስበርግ፡ ፒኤ፡ ኣመሪካ)፡ 0.198 ሚሊ ሊትር 1 ሜ ሳልፍዩሪክ ኣሲድ (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ከምኡ’ውን 0.176 ሚሊ ሊትር 100 ሚሊ ሜተር ፖታስየም ዳይክሮሜት (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA)፣ ድሕሪኡ እቲ ፍታሕ ብድስቲልድ ማይ ናብ 4.8 ሚሊ ሊትር ተቐላቒሉ፣ ብሓይሊ ተሓዋዊሱ ብቕጽበት ኣብ 60 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ማይ ተቐሚጡ ነብስኻ ምሕጻብ። ድሕሪ 10 ደቓይቕ 0.5 ሚሊ ሊትር ፍታሕ ሶድየም ሃይድሮክሳይድ (NaOH; 0.75 M) ብምውሳኽ እቲ ምላሽ ደው ኢሉ። ናይቲ ምላሽ ምትሕውዋስ ምምጥጣን (A600) ኣብ 600 ና.ሜ ብUV-160 ስፔክትሮፎቶሜተር (Shimadzu Corporation, Japan) ተጠቒምካ ተለኪዑ። ፒዲቢን ድስቲልድ ማይን ከም መቆጻጸሪ ንብዝሒ ናይ ባህሊ ፍልትሬትን ናሙናታት ተኽልን ብቕደም ተኸተል ተጠቒሞም እዮም። ኣብ ባህሊ ፍልትራት ብማይክሮግራም ኦክሳሊክ ኣሲድ ኣብ ሚሊሊተር ፒዲቢ ማእከላይ (μg.mL−1) ዝግለጽ ትሕዝቶ ኦክሳሊክ ኣሲድ፡ ከምኡ’ውን ኣብ ቆጽሊ ቆጽሊ ብማይክሮግራም ኦክሳሊክ ኣሲድ ኣብ ሓደ ግራም ፍሩይ ክብደት (μg.g−1 FW) ዝግለጽ፡ ብኦክሳሊክ ኣሲድ ምዕቃን መስመር (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ዝብል ጽሑፍ ኣቕሪቡ።
ኣብ ምሉእ እቲ መፅናዕቲ ኩሎም ፈተነታት ብሙሉእ ብዘይተሓሰበ መንገዲ ዝተነደፉ ኮይኖም ኣብ ነፍሲ ወከፍ ሕክምና ሽዱሽተ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋምን ኣብ ነፍሲ ወከፍ ስነ-ህይወታዊ ምድግጋም ሓሙሽተ ድስቲ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ድስቲ ክልተ ተኽሊ)ን ዝተነደፉ እዮም። ባዮሎጂካዊ ረፕሊኬት ብተደጋጋሚ (ክልተ ቴክኒካዊ ሪፕሊኬት) ተተንቲኑ። ናይ ሓደ ዓይነት ፈተነ ምብዛሕ ንምፍታሽ ቴክኒካዊ ምድግጋማት ተጠቒሞም እኳ እንተኾኑ ኣብ ስታቲስቲካዊ ትንተና ግን ናይ ሓሶት ምድግጋም ንምክልኻል ኣይተጠቐሙን። ዳታ ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትንተና ፍልልይ (ANOVA) ተጠቒምካ ተተንቲኑ ድሕሪኡ Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0.05) ተጠቒምካ እዩ። ንፈተነታት ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro experiments) IC50ን IC99ን ክብርታት ብፕሮቢት ሞዴል ተጠቒሞም ዝተቖፀሩ ኮይኖም 95% ናይ ምትእምማን ፍልልያት ተቖፂሮም እዮም።
ብድምር ኣርባዕተ ዝተነፀሉ ካብ ዝተፈላለዩ ግራት ሶያ ኣብ ምምሕዳር ኤል ጋብያ ግብፂ ዝተኣከቡ እዮም። ኣብ ፒዲኤ ማእከላይ ኩሎም ዝተነጸሉ ክሬም ዝመስል ጻዕዳ ማይሰሊየም ኣፍርዮም ቀልጢፉ ከም ጡጥ ዝመስል ጻዕዳ ዝቕየር (ስእሊ 1A) ድሕሪኡ ድማ ኣብ ደረጃ ስክለሮቲየም በርበረ ወይ ቡናዊ እዩ። ስክለሮቲያ መብዛሕትኡ ግዜ ጽዑቕ፣ ጸሊም፣ ክቢ ወይ ዘይስሩዕ ቅርጺ ዘለዎም፣ ካብ 5.2 ክሳብ 7.7 ሚ.ሜ ንውሓት ዘለዎም፣ ካብ 3.4 ክሳብ 5.3 ሚ.ሜ ዲያሜትር ዘለዎምን እዮም (ስእሊ 1ለ)። ኣርባዕተ ዝተነጸሉ ድሕሪ 10–12 መዓልታት ኣብ 25 ± 2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምሕቃቕ ኣብ ወሰን እቲ ባህላዊ መሳርሒ ወሰናስን ቅዲ ስክለሮትያ ዘማዕበሉ እኳ እንተኾኑ (ስእሊ 1A)፡ ቁጽሪ ስክለሮትያ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ጽላት ኣብ መንጎኦም ኣዝዩ ዝተፈላለየ እዩ ነይሩ (P < 0.001)፡ ዝተነጸሉ 3 ዝለዓለ ቁጽሪ ስክለሮትያ (32.33 ± 1.53 ስክለሮትያ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ጻሕሊ) ነይርዎም ጻሕሊ ስእሊ 1C)። ብተመሳሳሊ መንገዲ፡ ዝተነጸለ #3 ካብ ካልኦት ዝተነጸሉ (3.33 ± 0.49 μg.mL−1፤ ስእሊ 1D) ኣብ ፒዲቢ ዝያዳ ኦክሳሊክ ኣሲድ ኣፍርዩ። Isolate #3 ንቡር ሞርፎሎጂካውን ማይክሮስኮፒካውን ባህርያት ናይቲ ፋይቶፓቶጀኒክ ፋንጋስ Sclerotinia sclerotiorum ኣርእዩ። ንኣብነት ኣብ ፒዲኤ፡ ኮሎኒታት ናይ ዝተነጸለ #3 ብቕልጡፍ ዓብዩ፡ ክሬም ዝመስል ጻዕዳ (ስእሊ 1A)፡ ሪቨርስ ቢጅ ወይ ፍኹስ ዝበለ ሳልሞን ብጫ-ቡናዊ ኮይኑ፡ ንገጽ 9 ሴንቲ ሜተር ዲያሜትር ዘለዎ ጽላት ምሉእ ብምሉእ ንምሽፋን ኣብ 25 ± 2 ዲግሪ ሰንቲግሬድ 6-7 መዓልታት የድልዮ ነይሩ። ካብዚ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ ሞርፎሎጂካውን ማይክሮስኮፒካውን ባህርያት መሰረት ብምግባር ዝተነፀለ #3 ስክለሮቲኒያ ስክለሮቲዮረም ተባሂሉ ተለልዩ።
ስእሊ 1. ባህርያትን ረኽሲ ምፍጣርን ካብ ልሙዳት ዝራእቲ ሌጉሜን ዝተነፀሉ ኤስ.ስክለሮቲዮረም። (ሀ) ማይሰሊያል ዕብየት ኣርባዕተ S. sclerotiorum ዝተነፀሉ ኣብ PDA medium፣ (B) sclerotia ናይ ኣርባዕተ S. sclerotiorum ዝተነፀሉ፣ (C) ብዝሒ ስክለሮቲያ (ኣብ ነፍሲ ወከፍ ፃሕሊ)፣ (D) ምፍሳስ ኦክሳሊክ ኣሲድ ኣብ PDB medium (μg.mL−1)፣ ከምኡ እውን (E) ብርታዐ ሕማም (%) ኣርባዕተ S. sclerotiorum ዝተነፀሉ ኣብ ተቓላዕቲ ንግዳዊ ፍረታት cultivar Giza 3 ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን። ክብርታት ንማእከላይ ± SD ናይ ሓሙሽተ ስነ-ህይወታዊ ተደጋጋሚ (n = 5) ይውክሉ። ዝተፈላለዩ ፊደላት ኣብ መንጎ ሕክምናታት ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎ ፍልልይ ከምዘሎ ይሕብሩ (p < 0.05)። (F–H) ልሙዳት ምልክታት ጻዕዳ ሻምብቆ ኣብ ልዕሊ መሬት ኣብ ዝርከቡ ጕንዲታትን ሲሊክስን ብቕደም ተኸተል ድሕሪ 10 መዓልታት ድሕሪ ምኽታብ ብኢሶሌት #3 (dpi) ተራእዮም። (I) ፍልቀት ትንተና ናይቲ ውሽጣዊ ትራንስክሪፕትድ ስፔሰር (ITS) ዞባ ናይ S. sclerotiorum isolate #3 ዝለዓለ ተኽእሎ ኣገባብ ተጠቒምካ ተኻይዱን ምስ 20 መወከሲ ተነጸልቲ/ጽልዋታት ካብ ሃገራዊ ማእከል ሓበሬታ ባዮቴክኖሎጂ (NCBI) ዳታቤዝ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ዝተረኽቡ ተነጻጺሩ። ኣብ ልዕሊ መስመራት ምትእኽኻብ ዘለዉ ቁጽርታት ሽፋን ዞባ (%)፣ ኣብ ትሕቲ መስመራት ምትእኽኻብ ዝርከቡ ቁጽርታት ድማ ንውሓት ጨንፈር ዘመልክቱ እዮም።
ካብዚ ብተወሳኺ ረኽሲ ምፍጣር ንምርግጋፅ ኣርባዕተ ዝተረኸቡ ኤስ.ስክለሮቲዮረም ዝተነፀሉ ንብረታት ነቲ ተቓላዓይ ንግዳዊ ፋጁል ጊዛ 3 ኣብ ትሕቲ ኩነታት ምድረበዳ ንምኽታብ ተጠቒሞም እዮም፣ እዚ ድማ ምስ ናይ ኮች መርገፂታት ዝሰማማዕ እዩ (ስእሊ 1E)። ኩሎም ዝተረኸቡ ፋንጋስ ዝተነፀሉ ረኽሲ ዘስዕቡን ነቲ ቀጠልያ ፋጁል (cv. Giza 3) ክለኽፉ ዝኽእሉን እኳ እንተኾኑ፣ ኣብ ኩሎም ልዕሊ መሬት ዝርከቡ ክፍልታት (ስእሊ 1F)፣ ብፍላይ ኣብ 10 መዓልቲታት ድሕሪ ምኽታብ (dpi) ኣብ ጕንዲ (ስእሊ 1G)ን ቆፅሊ (ስእሊ 1H)ን ልሙድ ምልክታት ጻዕዳ ሻምብቆ ዘስዕቡን እኳ እንተኾኑ፣ ዝተነፀለ 3 ኣብ ክልተ ነፃ ፈተነታት እቲ ዝበዝሐ ዕጡቕ ተነፀልቲ እዩ ነይሩ። ዝተነፀለ 3 ዝለዓለ ብርታዐ ሕማም (%) ኣብ ተኽሊ ፋጁል (24.0 ± 4.0፣ 58.0 ± 2.0፣ ከምኡ እውን 76.7 ± 3.1 ኣብ 7፣ 14ን 21ን መዓልቲ ድሕሪ ረኽሲ ብቕደም ተኸተል፤ ስእሊ 1F) ነይርዎ።
ምልላይ ናይቲ ኣዝዩ ወራሪ ዝኾነ S. sclerotiorum isolate #3 ብዝያዳ ብውሽጣዊ ትራንስክሪፕትድ ስፔሰር (ITS) መስርዕ (ስእሊ 1I) መሰረት ተረጋጊጹ። ኣብ መንጎ ዝተነፀለ #3ን 20ን መወከሲ ዝተነፀሉ/ፅግዕተኛታት ፋይሎጀነቲካዊ ትንተና ኣብ መንጎኦም ልዑል ተመሳሳልነት (>99%) ኣርእዩ። ኣብዚ ምፍላጥ ዝግበኦ፡ ኤስ.ስክለሮቲዮረም ዝተነጸለ #3 (533 bp) ምስቲ ካብ ደረቕ ዘርኢ ኣተር ዝተነጸለ ኣመሪካዊ ኤስ OR206374.1፤ እቲ ሓድሽ መስርዕ ኣብ ዳታቤዝ NCBI ተቐሚጡ “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792) ተባሂሉ ተሰይሙ ኣሎ። isolate 3 እቲ ዝበዝሐ ወራሪ isolate ምዃኑ ክርአ ይከኣል፤ ስለዚ እዚ ተነጺሉ ኣብ ኩሉ ስዒቡ ዝመጸ ፈተነታት ንመጽናዕቲ ተመሪጹ።
ጸረ-ባክተርያ ንጥፈት ናይቲ ዳይኣሚን ኤል-ኦርኒታይን (ሲግማ-ኣልድሪች፡ ዳርምስታድ፡ ጀርመን) ኣብ ዝተፈላለየ ትሕዝቶ (12.5፡ 25፡ 50፡ 75፡ 100ን 125 ሚግ/ሊትርን) ኣንጻር ኤስ. ኤል-ኦርኒታይን ጸረ-ባክተርያ ውጽኢት ከም ዘሕደረን በብቑሩብ ንራድያል ዕብየት ኤስ. ኣብቲ ዝለዓለ ዝተፈተነ ትሕዝቶ (125 ሚሊግራም/ሊትር)፡ ኤል-ኦርኒታይን ዝለዓለ ደረጃ ምዕጋት ዕብየት ማይሰልያ (99.62 ± 0.27%፤ ስእሊ 2B) ኣርእዩ፣ እዚ ድማ ምስቲ ንግዳዊ ፋንጋስ ፀረድ ሪዞሌክስ-ቲ (ደረጃ ምዕጋት 99.45 ± 0.39%፤ ስእሊ 2C) ኣብቲ ዝለዓለ ዝተፈተነ ትሕዝቶ (10 ሚግ/ሊትር) ማዕረ እዩ ነይሩ፣ እዚ ድማ ተመሳሳሊ ምዃኑ የመልክት። ውጽኢታዊነት ምዃኑ’ዩ።
ስእሊ 2. ኣብ ውሽጢ መርመራ (in vitro) ጸረ-ባክተርያ ንጥፈታት ኤል-ኦርኒቲን ኣንጻር ስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም። (ሀ) ምውድዳር ጸረ-ባክተርያ ንጥፈታት ዝተፈላለየ ትሕዝቶ ኤል-ኦርኒታይን ኣንጻር ኤስ. (B, C) ድሕሪ ምሕካም ብዝተፈላለየ ትሕዝቶ L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 and 125 mg/L) ወይ Rizolex-T (2, 4, 6, 8 and 10 mg/L) ዕብየት ማይሰሊያል ኤስ. ክብርታት ንማእከላይ ± SD ናይ ሓሙሽተ ስነ-ህይወታዊ ተደጋጋሚ (n = 5) ይውክሉ። ዝተፈላለዩ ፊደላት ኣብ መንጎ ሕክምናታት ዘሎ ስታቲስቲካዊ ፍልልይ ዘመልክቱ እዮም (p < 0.05)። (D, E) ፕሮቢት ሞዴል ሪግረሽን ትንተና ናይ L-ornithineን ንግዳዊ ፋንጋስ ቐታሊ Rizolex-Tን ብቕደም ተኸተል። እቲ ፕሮቢት ሞዴል ሪግረሽን መስመር ከም ጽኑዕ ሰማያዊ መስመር ይርአ፣ እቲ ናይ ምትእምማን ፍልልይ (95%) ድማ ከም ስርዝ ድልዝ ዝበለ ቀይሕ መስመር ይርአ።
ብተወሳኺ ፕሮቢት ሪግረሽን ትንተና ተኻይዱ ተዛመድቲ ፕሎታት ኣብ ሰሌዳ ቁፅሪ 1ን ስእሊ 2D,Eን ተገሊፆም ኣለው። ብሓጺሩ፡ ቅቡል ዋጋ ቁልቁለት (y = 2.92x − 4.67)ን ተዛመድቲ ትርጉም ዘለዎም ስታቲስቲክስን (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 and p < 0.0001; ስእሊ 2D) ናይ L-ornithine ምስቲ ንግዳዊ ፋንጋስ ጸረ-ፋንጋስ ክነጻጸር እንከሎ ዝዓበየ ጸረ-ፋንጋስ ንጥፈት ከምዘለዎ ኣመልኪቱ ሪዞሌክስ-ቲ (y = 1.96x − 0.99፣ ኮክስ ኤንድ ስነል R2 = 0.1242፣ ናገልከርከ R2 = 0.1708ን p < 0.0001ን) (ሰንጠረዥ 1)።
ሰንጠረዥ 1. ክብርታት ፍርቂ-ዝለዓለ ተዓጻጻፊ ምትእኽኻብ (IC50)ን IC99 (mg/l)ን L-ornithineን ንግዳዊ ፋንጋስ ቐታሊ “Rizolex-T”ን ኣንጻር S. sclerotiorum።
ብሓፈሻ፡ L-ornithine (250 mg/L) ኣብ ዝተሓከሙ ልሙዳት ተኽልታት ፋጁል ምስ ዘይተሓከሙ ብኤስ. ብሓጺሩ፡ ዋላ’ኳ ጽንኩርነት ሕማም ናይቶም ዘይተሓከሙ ዝተለኽፉ ቁጽጽር ተኽልታት በብቑሩብ እንተወሰኸ (52.67 ± 1.53፡ 83.21 ± 2.61፡ ከምኡ’ውን 92.33 ± 3.06%)፡ ኤል-ኦርኒታይን ግን ኣብ ምሉእ እቲ ፈተነ ጽንኩርነት ሕማም (%) ብዓቢኡ ኣጉዲልዎ (8.97 ± 0.15፡ 18.00 ± 1.00፣ ከምኡውን 26.36 ± 3.07) ኣብ 7፣ 14ን 21ን መዓልታት ድሕሪ ሕክምና (dpt)፣ ብቕደም ተኸተል (ስእሊ 3ሀ)። ብተመሳሳሊ ብS. sclerotiorum ዝተለኽፉ ተኽልታት ፋቱላ ብ250 mg/L L-ornithine ክሕከሙ ከለዉ ኣብ ትሕቲ ሕማም ምዕባለ መስመር (AUDPC) ዘሎ ስፍሓት ኣብቲ ዘይተሓከመ ቁፅፅር ካብ 1274.33 ± 33.13 ናብ 281.03 ± 7.95 ወሪዱ፣ እዚ ድማ ካብቲ ኣወንታዊ ቁፅፅር 50 mg/L ቁሩብ ዝወሓደ እዩ። ሪዞሌክስ-ቲ ፋንጋስሳይድ (183.61 ± 7.71፤ ስእሊ 3ለ)። ኣብ ካልኣይ ፈተነ እውን ተመሳሳሊ ዝንባለ ተራእዩ።
ስእሊ 3. ጽልዋ ኤክዞጀናዊ ምጥቃም ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ምምዕባል ጻዕዳ ምብስባስ ናይ ልሙድ ፋጁል ብስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን ዝመጽእ። (ሀ) ድሕሪ ምሕካም ብ250 ሚግ/ሊትር ኤል-ኦርኒታይን ጻዕዳ ሻምብቆ ናይ ልሙድ ፋጁል ናይ ሕማም ምዕባለ መስመር። (B) ኣብ ትሕቲ ሕማም ምዕባለ መስመር (AUDPC) ጻዕዳ ሻምብቆ ናይ ልሙድ ፋጁል ድሕሪ ምሕካም ብኤል-ኦርኒታይን ዝርከብ ከባቢ። ክብርታት ንማእከላይ ± SD ናይ ሓሙሽተ ስነ-ህይወታዊ ተደጋጋሚ (n = 5) ይውክሉ። ዝተፈላለዩ ፊደላት ኣብ መንጎ ሕክምናታት ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎ ፍልልይ ዘመልክቱ እዮም (p < 0.05)።
250 ሚግ/ሊትር ኤል-ኦርኒታይን ካብ ደገ ምጥቃም ድሕሪ 42 መዓልታት ቁመት ተኽሊ (ስእሊ 4ሀ)፣ ብዝሒ ጨናፍር ኣብ ሓደ ተኽሊ (ስእሊ 4ለ)፣ ቁፅሪ ቆፅሊ ኣብ ሓደ ተኽሊ (ስእሊ 4ሐ) በብቑሩብ ኣዕብዩ። ንግዳዊ ፋንጋስ ፀረ-ቲ ሪዞሌክስ-ቲ (50 ሚሊግራም/ሊትር) ኣብ ኩሎም ዝተፅንዑ መለክዒታት ኣመጋግባ ዝለዓለ ፅልዋ ክህልዎ እንከሎ፣ 250 ሚሊግራም/ሊትር ኤል-ኦርኒታይን ካብ ደገ ምጥቃም ምስ ዘይተሓከሙ ቁፅፅር ክነፃፀር እንከሎ ካልኣይ ዝዓበየ ፅልዋ ነይርዎ (ስእልታት 4A–C)። ብኻልእ ወገን ድማ ፍወሳ ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ትሕዝቶ ፎቶሲንተቲክ ቀለም ክሎሮፊል ኤ (ስእሊ 4D)ን ክሎሮፊል ቢን (ስእሊ 4E) ዝኾነ ርኡይ ጽልዋ ኣይነበሮን፣ እንተኾነ ግን ምስቲ ኣሉታዊ ቁጽጽር (0.44 ± 0.02 ሚግ/ግ fr wt) ክነጻጸር እንከሎ ጠቕላላ ትሕዝቶ ካሮቲኖይድ (0.56 ± 0.03 ሚግ/ግራም fr wt) ቁሩብ ወሰኸ ኣወንታዊ ቁጽጽር (0.46 ± 0.02 ሚግ/ግራም fr wt; ስእሊ 4F)። ብሓፈሻ እዞም ውጽኢታት ከም ዘመልክትዎ፡ ኤል-ኦርኒታይን ንዝተሓከሙ ፍረታት ፋይቶቶክሲክ ከምዘይኮነን ንዕብየቶም ከይተረፈ ከነቓቕሕ ከምዝኽእልን ይሕብሩ።
ስእሊ 4. ጽልዋ ኤክዞጀናዊ ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ባህርያት ዕብየትን ፎቶሲንተቲክ ቀለምን ብስክለሮቲንያ ስክለሮቲዮረም ዝተለኽፉ ቆጽሊ ፋጁል ኣብ ትሕቲ ኩነታት ጀሪካን። (ሀ) ቁመት ተኽሊ (cm)፣ (ለ) ብዝሒ ጨናፍር ኣብ ሓደ ተኽሊ፣ (ሐ) ብዝሒ ቆፅሊ ኣብ ሓደ ተኽሊ፣ (መ) ትሕዝቶ ክሎሮፊል a (mg g-1 fr wt)፣ (E) ትሕዝቶ ክሎሮፊል b (mg g-1 fr wt)፣ (F) ጠቕላላ ትሕዝቶ ካሮቲኖይድ (mg g-1 fr wt)። ክብርታት ማእከላይ ± SD ናይ ሓሙሽተ ስነ-ህይወታዊ ተደጋጋሚ (n = 5) እዮም። ዝተፈላለዩ ፊደላት ኣብ መንጎ ሕክምናታት ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎ ፍልልይ ከምዘሎ ይሕብሩ (p < 0.05)።
ኣብ ቦታኡ ሂስቶኬሚካላዊ ምምቕቓል ርእሰ-ተኣማንነት ዘለዎም ዓይነታት ኦክስጅን (ROS; ብሃይድሮጅን ፐሮክሳይድ [H2O2] ዝግለጽ)ን ነጻ ራዲካላትን (ብሱፐርኦክሳይድ ኣንዮናት [O2•−] ዝግለጽ) ንደገዊ ኣጠቓቕማ L-ornithine (250 mg/L) ንውህለላ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW) ብዓቢኡ ከም ዘጉድሎ ኣረጋጊጹ፤ ስእሊ 5ሀ)ን O2•−ን (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; ስእሊ 5B) ምስ ምውህላል ክልቲኦም ዘይተሓከሙ ዝተለኽፉ ተኽልታት (173.31 ± 12.06ን 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FWን ብቕደም ተኸተል) ከምኡ’ውን ብ50 ሚግ/ሊትር ንግዳዊ ፋንጋስሳይድ ዝተሓከሙ ተኽልታት ክነጻጸር ከሎ ሪዞሌክስ-ቲ (170.12 ± 9.50ን 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wtን ብቕደም ተኸተል) ኣብ 72 ሰዓት። ልዑል መጠን H2O2ን O2•−ን ኣብ ትሕቲ hpt ተዋህሊሉ (ስእሊ 5A, B)። ብተመሳሳሊ TCA-based malondialdehyde (MDA) assay ብS. sclerotiorum ዝተለኽፉ ተኽልታት ፋጁል ኣብ ቆፅሎም ዝለዓለ መጠን MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) ከምዘዋህለሉ ኣረጋጊፁ እዩ (ስእሊ 5C)። ይኹን እምበር፡ ካብ ደገ ምጥቃም L-ornithine፡ ኣብ ዝተሓከሙ ተኽልታት ብዝተራእየ ምንካይ ትሕዝቶ MDA (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) ከም ዝተረጋገጸ፡ lipid peroxidation ብዓቢኡ ከም ዝቐነሶ።
ስእሊ 5. ጽልዋ ኤክዞጀናዊ ኤል-ኦርኒታይን ኣብ ዓበይቲ ምልክታት ኦክሲዳቲቭ ጸቕጥን ዘይ-ኢንዛይማዊ ጸረ-ኦክስጅን መከላኸሊ ኣገባባትን ኣብ ቆጽሊ ፋጁል ብኤስ. (ሀ) ሃይድሮጅን ፐሮክሳይድ (H2O2; nmol g−1 FW) ኣብ 72 hpt, (B) ሱፐርኦክሳይድ ኣንዮን (O2•−; nmol g−1 FW) ኣብ 72 hpt, (C) ማሎንዲኣልደሃይድ (MDA; nmol g−1 FW) ኣብ 72 hpt, (D) ጠቕላላ ዝፈስሱ ፊኖላት (mg GAE g−1 FW) ኣብ 72 hpt, (E) ጠቕላላ ዝፈስሱ ፍላቮኖይድስ (mg RE g−1 FW) ኣብ 72 hpt፣ (F) ጠቕላላ ነጻ ኣሚኖ ኣሲዳት (mg g−1 FW) ኣብ 72 hpt፣ ከምኡ’ውን (G) ትሕዝቶ ፕሮሊን (mg g−1 FW) ኣብ 72 hpt። ክብርታት ንማእከላይ ± መደበኛ ምዝንባል (ማእከላይ ± SD) ናይ 5 ስነ-ህይወታዊ ተደጋጋሚ (n = 5) ይውክሉ። ዝተፈላለዩ ፊደላት ኣብ መንጎ ሕክምናታት ብስታቲስቲካዊ ኣገባብ ትርጉም ዘለዎ ፍልልይ ከምዘሎ ይሕብሩ (p < 0.05)።