ህሉው *ናይ ሕጂ ኣድራሻ፡ ኮሎን 50931፡ ጀርመን፡ ኮሎን ኤክሰለንስ ክላስተር ሪሰርች ኦን ሴሉላር ጸቕጢ ምላሽ ኣብ እርጋን ዝተኣሳሰሩ ሕማማት (CECAD)።
ናይ ማይቶኮንድርያል ሕማማት ኒውሮዲጀነሬሽን ከም ዘይምለስ ይቑጸር ምኽንያቱ ናይ ኒውሮናት ምትሕልላፍ ፕላስቲሲቲ ድሩት እዩ፣ እንተኾነ ግን ጽልዋ ናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ ኣብ ዋህዮታት ርእሰ-ምሕደራ ኒውሮናዊ ምትሕልላፍ ኣብ ኣካላትና ብሕማቕ ኣይተረድአን። ኣብዚ፡ ብሰንኪ ዝተበታተነ ማይቶኮንድርያል ፍዩዥን ዳይናሚክስ ዝመጽእ ገስጋሲ ሕጽረት ኦክስፎስ ዘለዎም ዋህዮ-ፍሉይ ፕሮቲዮም ናይ ፑርኪንጀ ኒውሮናት ነላልየኩም። ምዝንባዕ ስራሕ ማይቶኮንድርያ ኣብ ዓውዲ ፕሮቲዮሚክስ ዓሚቝ ለውጢ ከም ዘበገሰ ረኺብናዮ፣ ኣብ መወዳእታ ድማ ቅድሚ ሞት ዋህዮታት ተኸታታሊ ምንቅስቓስ ልክዕ መደባት ምትሕውዋስ መግቢ ከም ዘስዕብ ረኺብናዮ። ብዘይተጸበናዮ መንገዲ፡ ርኡይ ምልዕዓል ፓይሩቫት ካርቦክሳይለዝ (PCx)ን ካልኦት ምስ ምምልላእ ናይ TCA ዑደት መንጎኛታት ዝተኣሳሰር ፐሮክሳይደዝን ወሲንና። ምዕጋት ፒሲኤክስ ንኦክሲዳቲቭ ጸቕጥን ኒውሮዲጀነሬሽንን ኣጋዲዱ፡ እዚ ድማ ኣተሮስክለሮሲስ ኣብቶም ኦክስፎስ ዘይብሎም ኒውሮናት መከላኸሊ ውጽኢት ከም ዘለዎ የመልክት። ኣብ መወዳእታ ዝበላሸዉ ኒውሮናት ማይቶኮንድርያል ፍዩዥን ምምላስ ነዞም ናይ ምምሕያሽ ባህርያት ምሉእ ብምሉእ ይገልብጦም፣ በዚ ድማ ሞት ዋህዮታት ይከላኸል። ርኽበታትና ቅድሚ ሕጂ ዘይፍለጡ መንገድታት ብምልላይ ንናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ ተጻዋርነት ዝህቡን ኒውሮዲጀነሬሽን ኣብ ዳሕረዋይ ደረጃታት ናይቲ ሕማም ከይተረፈ ክምለስ ከምዝኽእልን ዘርኢ እዩ።
ማእከላይ ተራ ማይቶኮንድርያ ኣብ ምዕቃብ ምትሕልላፍ ጸዓት ኒውሮን፡ ምስ ሕማማት ማይቶኮንድርያ ደቂ ሰባት ዝተኣሳሰሩ ሰፊሕ ናይ ኒውሮሎጂ ምልክታት ይጉልሕ። መብዛሕትኦም እዞም ሕማማት ብናይ ማይቶኮንድርያል ጂን መግለጺ (1, 2) ዝቆጻጸሩ ጂን ሚውቴሽን ወይ ምስ ማይቶኮንድርያል ዳይናሚክስ ዝተኣሳሰር ጂን ምጥፋእ ዝመጹ ኮይኖም፡ እዚ ድማ ብተዘዋዋሪ መንገዲ ንምርግጋእ ማይቶኮንድርያል ዲኤንኤ (mtDNA) ይጸልዎ (3, 4)። ኣብ ሞዴላት እንስሳታት ዝተገብረ ስራሕ ከም ዘመልክቶ፡ ኣብ ከባቢ ቲሹታት ንዝፍጠር ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያል ምላሽ ንምሃብ፡ ዓቃባዊ መንገድታት ምትሕልላፍ መግቢ (5-7) ክነጥፉ ይኽእሉ፡ በዚ ድማ ኣብ ምፍጣር ሕማም ናይዞም ዝተሓላለኹ ሕማማት ኣገዳሲ ርድኢት ይህብ። ብኣንጻሩ፡ ብሰንኪ ሓፈሻዊ ውድቀት ምፍራይ ማይቶኮንድርያል ኣዴኖሳይን ትራይፎስፌት (ATP) ሓንጎል ዝመጽእ ለውጢ መቦሊክ ፍሉያት ዓይነታት ዋህዮታት ዘለና ርድኢት መሰረታዊ እዩ (8)፡ እዚ ድማ ሕማም ንምክልኻል ወይ ንምክልኻል ክውዕሉ ዝኽእሉ ፍወሳዊ ዕላማታት ምልላይ ከምዘድሊ የጉልሕ። ምብስባስ ኒውሮ ምክልኻል (9)። እቲ ስእነት ሓበሬታ፡ ዋህዮታት ነርቭ ምስቶም ኣብ ከባቢኦም ዝርከቡ ዓይነታት ዋህዮታት ክነጻጸሩ እንከለዉ፡ ኣዝዩ ድሩት ናይ ምምሕያሽ ምትሕውዋስ ተዓጻጻፍነት ከም ዘለዎም ብሰፊሑ ይግለጽ (10)። እዞም ዋህዮታት ንሲናፕቲክ ምትሕልላፍ ንምድንፋዕን ንኹነታት መጉዳእትን ሕማምን ምላሽ ንምሃብን ቀረብ መተቦላይት ናብ ኒውሮናት ኣብ ምውህሃድ ማእከላይ ተራ ከምዘለዎም ኣብ ግምት ብምእታው፡ ንመተቦላይዝ ዋህዮታት ምስቲ በዳሂ ኩነታት ቲሹ ሓንጎል ናይ ምትዕጽጻፍ ዓቕሚ ዳርጋ ኣብ ዋህዮታት ግሊያል ዝተሓጽረ እዩ (11-14)። ብተወሳኺ፡ እቲ ባህርያዊ ዋህዮኣዊ ዘይምስምማዕ ቲሹ ሓንጎል፡ ኣብ ፍሉያት ንኡሳን ጉጅለታት ኒውሮን ዝፍጠሩ ለውጥታት ምምሕያሽ መግቢ ንምጽናዕ ብዓቢኡ ይዕንቅፍ። ከም ውጽኢቱ ድማ፡ ብዛዕባ ልክዕ ዋህዮኣውን ምትሕውዋሳውን ሳዕቤናት ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ኣብ ኒውሮናት ብዙሕ ኣይፍለጥን።
ንመቦሊክ ሳዕቤናት ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ንምርዳእ፡ ኣብ ዝተፈላለየ ደረጃታት ናይ ኒውሮዲጀነሬሽን ብሰንኪ ዕንወት ማይቶኮንድርያል ደጋዊ ሽፋን ምትሕውዋስ (Mfn2) ዝመጽእ ኒውሮናት ፑርኪንጀ (PNs) ነጺልናዮም። ዋላ እኳ ኣብ ደቂ ሰባት ዝረአ Mfn2 ምትዕርራይ ምስ ሓደ ዓይነት ውርሻዊ ሞተር ህዋሳዊ ኒውሮፓቲ ብ Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) ዝፍለጥ እንተኾነ፡ ኣብ ኣእዋም ብኹነታዊ ምጥፋእ Mfn2 ግን ጽቡቕ ኣፍልጦ ዘለዎ ምልዕዓል ኦክሳይድ ፎስፎርላይዜሽን (OXPHOS) ምዝንባዕ ሜላ እዩ። እቶም ዝተፈላለዩ ንኡሳን ዓይነታት ኒውሮን (16-19)ን እቲ ውጽኢት ዝኾነ ኒውሮዲጀነሬቲቭ ፊኖታይፕን ብገስጋሲ ናይ ኒውሮሎጂ ምልክታት ይስነዩ፣ ከም ናይ ምንቅስቓስ ጸገማት (18, 19) ወይ ሴረቤላር ኣታክስያ (16)። ውህደት ምልክት-ነጻ ብዝሒ (LFQ) ፕሮቲዮሚክስ፡ ሜታቦሎሚክስ፡ ምስሊ፡ ከምኡ’ውን ቫይሮሎጂካዊ ኣገባባት ብምጥቃም፡ ገስጋሲ ኒውሮዲጀነሬሽን ብሓያል መንገዲ ፓይሩቫት ካርቦክሳይለዝ (PCx)ን ካልኦት ኣብ ኣርተሪዮስክለሮሲስ ናይ PNs ኣብ vivo ዝሳተፉ ረቛሒታትን ከም ዝድርኽ ነርኢ መግለጺ ኢንዛይማት። ተዛማድነት ናይዚ ርኽበት ንምርግጋጽ፡ ብፍሉይ ንመግለጺ PCx ኣብ Mfn2-ጉድለት PNs ንታሕቲ ምቁጽጻር፡ እዚ ስርሒት ድማ ንኦክሲዳቲቭ ጸቕጥን ከም ዘቀላጠፍን ረኺብናዮ፡ በዚ ድማ azoospermia ሞት ዋህዮታት Metabolic adaptability ከም ዝህብ ኣረጋጊጽና። ከቢድ መግለጺ MFN2 ነቲ ተርሚናል ዲጀነሬሽን ፒኤን ምስ ከቢድ ሕጽረት ኦክስፎስ፡ ብብዝሒ ምውሳድ ዲኤንኤ ማይቶኮንድርያ፡ ከምኡ’ውን ዝተሰብረ መርበብ ማይቶኮንድርያል ዝመስልን ምሉእ ብምሉእ ከድሕኖ ይኽእል እዩ፡ እዚ ድማ እዚ ዓይነት ምብስባስ ኒውሮ ቅድሚ ሞት ዋህዮታት ኣብ ምዕቡል ደረጃ ሕማም ከይተረፈ ክሓዊ ከም ዝኽእል ዝያዳ የጉልሕ።
ኣብ Mfn2 knockout PNs ማይቶኮንድርያ ንምስኣል፡ Cre-ዝምርኮስ ማይቶኮንድርያ ብጫ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (YFP) (mtYFP) (20) Cre መግለጺ ዕላማ ንምግባር ዘኽእል ናይ ኣንጭዋ ጽላት ተጠቒምና ኣብ vivo ሞርፎሎጂ ማይቶኮንድርያ ፈቲሽና። ኣብ PNs ምጥፋእ Mfn2 ጂን ቀስ ብቐስ ምምቕቓል መርበብ ማይቶኮንድርያ ከም ዘስዕብ ረኺብናዮ (ስእሊ S1A)፣ እቲ ዝቐደመ ለውጢ ድማ ኣብ 3 ሰሙን ዕድመ ተረኺቡ። ብኣንጻሩ፡ ከምቲ ምጥፋእ ካልቢንዲን ኢሙኖስታይኒንግ መርትዖ ዝኾነ፡ እቲ ርኡይ ምብስባስ ናይቲ ፒኤን ዋህዮ ንጣብ፡ ክሳብ 12 ሰሙን ዕድመ ኣይጀመረን (ስእሊ 1፡ ሀን ለን)። ኣብ መንጎ እቶም ቀዳሞት ለውጥታት ሞርፎሎጂ ማይቶኮንድርያን ርኡይ ምጅማር ሞት ኒውሮንን ዝነበረ ናይ ግዜ ዘይምትእስሳር፡ ቅድሚ ሞት ዋህዮታት ብሰንኪ ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያል ዝመጽእ ለውጢ ምምሕያሽ መግቢ ክንምርምር ደሪኹና። ንሕና ፍሎረሰንስ-ንጡፍ ዋህዮ ምፍላይ (FACS)-መሰረት ዝገበረ ስትራተጂ ንYFP (YFP +)-ዝገልጽ PN (ስእሊ 1C) ንምንጻል ኣማዕቢልና, ከምኡ’ውን ኣብ ቁጽጽር ኣእዋም (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ካብዚ ንደሓር CTRL (ስእሊ S1B) ተባሂሉ ይጽዋዕ. ኣብ ኣንጻራዊ ጽዓት ናይ YFP ምልክት ዝተመርኮሰ ምምሕያሽ ናይቲ gating ስትራተጂ፡ ብኮንፎካል ማይክሮስኮፕ (ስእሊ S1D፡ የማን) ዝተረጋገጸ፡ ካብ ዘይ-PNs (YFPneg) (ስእሊ S1B) ወይ ግምታዊ ፍሎረሰንት ኣክሶን/ዴንድሪቲክ ቁርጽራጻት (YFPlow; ስእሊ S1D፡ ጸጋም)፡ YFP+ ኣካል (YFPhigh) ናይ PNs ንምጽራይ የኽእለና። መንነት ናይቲ ዝተመደበ ህዝቢ ንምርግጋጽ፡ LFQ proteomics ድሕሪኡ ድማ principal component analysis ኣካይድና፡ ኣብ መንጎ YFPhighን YFPnegን ዋህዮታት ንጹር ምፍልላይ ከምዘሎ ረኺብናዮ (ስእሊ S1C)። YFPhigh ዋህዮታት ጽሩይ ምህብታም ናይ ዝፍለጡ PNs ምልክታት (ማለት Calb1, Pcp2, Grid2 and Itpr3) (21, 22) ኣርእዮም, ግን ዝኾነ ምህብታም ፕሮቲናት ልሙድ ኣብ ኒውሮናት ወይ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት ዝግለጹ (ስእሊ 1D) ). ኣብ መንጎ ናሙናታት ኣብ ዝተመደቡ YFPhigh ዋህዮታት ኣብ ነጻ ፈተነታት ዝተኣከቡ ንጽጽር ምትእስሳር ምልክት> 0.9 ኣርእዩ፣ እዚ ድማ ኣብ መንጎ ስነ-ህይወታዊ ምብዛሕ ጽቡቕ ምብዛሕ ዘርኢ እዩ (ስእሊ S1E)። ብሓጺሩ እዞም ዳታታት ንውጥንና ንሕዱርን ፍሉይን ተነጽሎ ናይ ተግባራዊ ፒኤን ኣረጋጊጾም። እቲ ዝጥቀመሉ L7-cre ድራይቨር ስርዓት ድሕሪ ሕርሲ ኣብ ቀዳማይ ሰሙን ሞዛይክ ዳግመ-ውህደት ስለዘለዓዕል (23)፡ ካብ CTRLን ኩነታዊ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ኒውሮናት ምእካብን ኣእዋም ምቕታል ጀሚርና። ዳግመ-ውህደት ምስተዛዘመ ኣብ 4 ሰሙን ዕድመ Mfn2cKO ይበሃል። ከም መወዳእታ ነጥቢ፡ ዋላ እኳ ርኡይ ቁርጽራጽ ማይቶኮንድርያ እንተሃለወ፡ እቲ ፒኤን ንጣብ ገና ዘይተበላሸወ ኣብ ዝነበረሉ እዋን 8 ሰሙን ዕድመ መሪጽና (ስእሊ 1Bን ስእሊ S1Aን)። ብሓፈሻ፡ ብድምር 3013 ፕሮቲናት ብቑጽሪ ገይርናዮም፡ ካብዚኦም ኣስታት 22% ኣብ ማይቶኮንድርያል ፕሮቲዮም ከም ማይቶኮንድርያ (ስእሊ 1E) (ስእሊ 1E) (24) ዝተመርኮሰ ኣብ MitoCarta 2.0 መግለጺታት ዝተመርኮሰ እዩ። ኣብ ሰሙን 8 ዝተኻየደ ዲፈረንሻል ጂን ኤክስፕሬሽን ትንተና ካብ ኩሎም ፕሮቲናት 10.5% ጥራሕ ርኡይ ለውጢ ከምዘለዎም ኣርእዩ (ስእሊ 1Fን ስእሊ S1Fን) ካብዚኦም 195 ፕሮቲናት ንታሕቲ ዝተቖፃፀሩ እንትኾኑ 120 ፕሮቲናት ድማ ንላዕሊ ዝተመሓደሩ እዮም (ስእሊ 1F)። ኣብዚ ስብስብ መረዳእታ “መሃዚ መንገዲ ትንተና” ከምዘርእዮ እቶም ብፍልልይ ዝግለጹ ጂናት ብቐንዱ ካብ ዝተገደቡ ስብስብ ፍሉያት መንገድታት ምምሕያሽ መግቢ ምዃኖም ይሕብር (ስእሊ 1G)። እቲ ዝገርም፡ ዋላ’ኳ ምስ OXPHOSን ካልሲየም ምልክትን ዝተኣሳሰሩ መንገድታት ምውራድ ኣብ ፍዩዥን-ጉድለት ዘለዎም PNs ምልዕዓል ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ዘረጋግጽ እንተኾነ፡ ካልኦት ብቐንዱ ንመተቦሊዝም ኣሚኖ ኣሲድ ዘጠቓልሉ ምድባት ግን ብዓቢኡ ንላዕሊ ዝቆጻጸሩ ኮይኖም፡ እዚ ድማ ምስቲ ኣብ ማይቶኮንድርያል PNs ዝፍጠር ምትሕልላፍ መግቢ ዝሰማማዕ እዩ። ዳግመ-ገመድ ምትእስሳር ቅኑዕ እዩ። ምዝንባዕ ስራሕ።
(ሀ) ውክልና ዘለዎም ኮንፎካል ስእልታት ናይ ሴሬቤላር ክፍልታት ናይ CTRLን Mfn2cKOን ኣእዋም ገስጋሲ ክሳራ PNs (calbindin, grey) ዘርኢ፤ ኒውክለስ ብDAPI counterstained ተገይሩ። (B) ብዝሒ (A) (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፣ ***P<0.001፤ n = 4 ክሳብ 6 ዓንኬላት ካብ ሰለስተ ኣእዋም)። (ሐ) ፈተነኣዊ ዋሕዚ ስራሕ። (መ) ዝርገሐ ካርታ ሙቐት ንፑርኪንጀ (ላዕሊ)ን ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታትን (ማእከላይ) ፍሉያት ምልክታት። (E) ኣብቲ ዝተመደበ PN ዝተለለዩ ብዝሒ ማይቶኮንድርያል ፕሮቲናት ዘርኢ ቬን ስእላዊ ስእሊ። (F) እሳተ ጎመራ ፕሎት ናይ ብፍልልይ ዝተገልጹ ፕሮቲናት ኣብ Mfn2cKO ኒውሮናት ኣብ 8 ሰሙን (ኣገዳስነት ምቁራጽ ዋጋ 1.3)። (G) ትንተና መንገዲ ፈጠራ ኣብ Mfn2cKO PN ከም 8 ሰሙን ዝተመደቡ ሓሙሽተ ኣገደስቲ ናይ ላዕሊ ምቁጽጻር (ቀይሕ)ን ንታሕቲ ምቁጽጻርን (ሰማያዊ) መንገድታት የርኢ። ማእከላይ ደረጃ መግለጺ ነፍሲ ወከፍ ዝተረኽበ ፕሮቲን ተገሊጹ ኣሎ። ግራይስኬል ዋዒ ካርታ: ዝተስተኻኸለ P ዋጋ። ns, ኣገዳሲ ኣይኮነን።
ዳታ ፕሮቲዮሚክስ ከም ዘመልክቶ፡ መግለጺ ፕሮቲን ናይ ኮምፕለክስ I, III, IV በብቑሩብ ከም ዝነከየ ይሕብር። ውስብስብ I, IIIን IVን ኩሎም ኣገደስቲ ብmtDNA ዝተመዝገቡ ንኡሳን ኣሃዱታት ዝሓዙ ክኾኑ እንከለዉ፡ እቲ ብኒዩክለር ጥራይ ዝተመዝገበ ኮምፕለክስ II ድማ ብመሰረቱ ኣይተተንከፈን (ስእሊ 2Aን ስእሊ S2Aን)። . ምስ ውጽኢት ፕሮቲዮሚክስ ዝሰማማዕ፡ ኢሙኖሂስቶኬሚስትሪ ናይ ሴረቤላር ቲሹ ክፍልታት፡ MTCO1 (ማይቶኮንድርያል ሳይቶክሮም ሲ ኦክሳይድ ንኡስ ኣሃዱ 1) ንኡስ ኣሃዱ ደረጃ ናይ ኮምፕለክስ IV ኣብ ፒኤን በብቑሩብ ከም ዝነከየ ኣርእዩ (ስእሊ 2B)። እቲ ብmtDNA ዝተመዝገበ ንኡስ ኣሃዱ Mtatp8 ብዓቢኡ ክጎድል እንከሎ (ስእሊ S2A)፣ ደረጃ ርጉእ ኩነታት ናይቲ ብኒዩክለር ዝተመዝገበ ATP synthase ንኡስ ኣሃዱ ከምዘይተቐየረ ክቕጽል እንከሎ፣ እዚ ድማ ምስቲ ዝፍለጥ ርጉእ ATP synthase subassembly F1 complex ዝሰማማዕ እዩ mtDNA መግለጺ ርጉእ ኣብ ዝኾነሉ እዋን። እቲ ኣቃውማ ቅኑዕ እዩ። ምቁራጽ (7)። ኣብቶም ዝተሰርዑ Mfn2cKO PNs ብናይ ሓቂ ግዜ ፖሊሜረዝ ሰንሰለታዊ ምላሽ (qPCR) ደረጃ mtDNA ምግምጋም ቀስ ብቐስ ቁጽሪ ቅዳሕ mtDNA ከምዝነከየ ኣረጋጊጹ። ምስቲ ቁጽጽር ዝገበረ ጉጅለ ክነጻጸር እንከሎ፡ ኣብ 8 ሰሙን ዕድመ፡ ኣስታት 20% ጥራይ ካብ ደረጃ mtDNA እዩ ተዓቂቡ (ስእሊ 2C)። ምስዞም ውጽኢታት ዝሰማማዕ፡ ዲኤንኤ ንምፍላጥ Mfn2cKO PNs ብኮንፎካል ማይክሮስኮፒ ምልካይ፡ ኣብ ግዜ ዝምርኮስ ሃልኪ ማይቶኮንድርያል ኒውክሊዮታይድስ ዘርኢ እዩ (ስእሊ 2D)። ኣብ ምብስባስ ፕሮቲን ማይቶኮንድርያን ምላሽ ጸቕጥን ዝሳተፉ ገለ ሕጹያት ጥራይ ንላዕሊ ከምዝተመሓደሩ ረኺብናዮም፣ Lonp1, Afg3l2 and Clpx, ከምኡ’ውን OXPHOS complex assembly factors ሓዊሱ። ኣብ ደረጃታት ፕሮቲናት ኣብ ኣፖፕቶሲስ ዝሳተፉ ርኡይ ለውጢ ኣይተረኽበን (ስእሊ S2B)። ብተመሳሳሊ ኣብ መጓዓዝያ ካልሲየም ዝሳተፉ ማይቶኮንድርያን ኢንዶፕላዝሚክ ረቲኩሉም ቻነላትን ንኣሽቱ ለውጥታት ጥራሕ ከምዘለዎም ረኺብናዮም (ስእሊ S2C)። ብተወሳኺ፡ ገምጋም ምስ ኣውቶፋጂ ዝተኣሳሰሩ ፕሮቲናት ዝኾነ ርኡይ ለውጢ ኣይረኸበን፡ እዚ ድማ ምስቲ ኣብ vivo ብኢሙኖሂስቶኬሚስትሪን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒን ዝተዓዘብናዮ ርኡይ ምልዕዓል ኣውቶፋጎዞም ዝሰማማዕ እዩ (ስእሊ S3)። ይኹን እምበር፡ እቲ ኣብ ፒኤን ዝረአ ገስጋሲ ምዝንባዕ ኦክስፎስ ብግልጺ ኣልትራስትራክቸራል ማይቶኮንድርያል ለውጢ ይስነ። ማይቶኮንድርያል ክላስተራት ኣብ ኣካላት ዋህዮታትን ደንድሪቲክ ኣግራብን ናይ Mfn2cKO PNs ዕድሚኦም 5ን 8ን ሰሙን ክረኣዩ ይኽእሉ፣ ውሽጣዊ ኣቃውማ ሽፋን ድማ ዓሚቕ ለውጢ ኣርእዩ እዩ (ስእሊ S4, A and B)። ምስዞም ኣልትራስትራክቸራል ለውጥታትን ርኡይ ምንካይ mtDNAን ዝሰማማዕ፡ ትንተና ናይ acute cerebral cerebellar slices ምስ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ኣብ Mfn2cKO PNs ዘሎ ናይ ማይቶኮንድርያል ሽፋን ዓቕሚ ብዓቢኡ ከም ዝነከየ ኣርእዩ (ስእሊ S4C)።
(ሀ) ትንታነ መስርሕ ግዜ ናይ መግለጺ ደረጃ ኦክስፎስ ኮምፕለክስ። ኣብ 8 ሰሙን P<0.05 ዘለዎም ፕሮቲናት ጥራይ ኣብ ግምት ኣእቱ (ክልተ-ኣንፈት ANOVA)። ነጥቢ ዘለዎ መስመር: ምስ CTRL ክነጻጸር ከሎ ምትዕርራይ የለን። (B) ጸጋም፡ ኣብነት ናይ ሓደ ብጸረ-MTCO1 ጸረ-ኣካል (scale bar, 20 μm) ዝተለጠፈ ክፋል ሴረቤላር። እቲ ብኣካላት ዋህዮታት ፑርኪንጀ ዝተታሕዘ ከባቢ ብብጫ ዝተሸፈነ እዩ። የማን: ብዝሒ ደረጃታት MTCO1 (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ n = 7 ክሳብ 20 ዋህዮታት ካብ ሰለስተ ኣእዋም ዝተተንተኑ)። (C) qPCR ትንተና ናይ mtDNA ቅዳሕ ቁጽሪ ኣብቲ ዝተሰርዐ PN (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ n = 3 ክሳብ 7 ኣእዋም)። (D) ጸጋም፡ ኣብነት ናይ ሴረቤላር ስላይስ ብጸረ-ዲኤንኤ ጸረ-ኣካል (scale bar, 20 μm) ዝተለጠፈ። እቲ ብኣካላት ዋህዮታት ፑርኪንጀ ዝተታሕዘ ከባቢ ብብጫ ዝተሸፈነ እዩ። የማን: ብዝሒ ናይ mtDNA ቁስሊ (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ n = 5 ክሳብ 9 ዋህዮታት ካብ ሰለስተ ኣእዋም)። (E) ኣብነት ናይ ሓደ acute cerebellar section ኣብ ምሉእ ዋህዮ ፓች ክላምፕ ምዝገባ mitoYFP + Purkinje ዋህዮታት (ፍላጻ) ዘርኢ። (ረ) ብዝሒ ናይ IV curve። (G) ተወካሊ ቅዳሓት ናይ ዲፖላራይዚንግ ዋሕዚ መርፍእ ኣብ CTRLን Mfn2cKOን ዋህዮታት ፑርኪንጀ። ላዕለዋይ ኣሰር: ንኤፒ ዘበገሰ ናይ መጀመርታ ናህሪ። ታሕተዋይ ኣሰር: ዝለዓለ ኤፒ ፍሪኩዌንሲ። (H) ብዝሒ ድሕሪ ሲናፕቲክ ስፖንታይን እታዎታት (sPSPs)። እቲ ውክልና ዘለዎ ናይ ምቕራጽ ኣሰርን ናይ ዙም ሬሽዮኡን ኣብ (I) ተገሊጹ ኣሎ። ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ ካብ ሰለስተ ኣእዋም ካብ n = 5 ክሳብ 20 ዋህዮታት ተንቲኑ። መረዳእታታት ብማእኸላይ±SEM ይግለፁ፤ *P<0.05፤ **P<0.01፤ ***P<0.001 ዝብል እዩ። (J) ተወከልቲ ኣሰር ናይ ስፖንታይን ኤፒ ብነዃል ዘለዎ ፓች ክላምፕ ሞድ ተጠቒምካ ዝተመዝገበ። ላዕለዋይ ኣሰር: ዝለዓለ ኤፒ ፍሪኩዌንሲ። ታሕተዋይ ኣሰር: ዙም ናይ ሓደ ኤፒ። (K) ማእኸላይን ዝለዓለን ፍሪኩዌንሲ ኤፒ ብመሰረት (J) ቁፅሪ ምግባር። ፈተና ማን-ዊትኒ፤ n = 5 ዋህዮታት ካብ ኣርባዕተ ኣእዋም ተተንቲኖም። መረዳእታታት ብማእኸላይ±SEM ይግለፁ፤ ኣገዳሲ ኣይኮነን።
ኣብቲ ን8 ሰሙን ዝዕድሚኡ Mfn2cKO PN ርኡይ ናይ OXPHOS ጉድኣት ተረኺቡ፡ እዚ ድማ ፊዚዮሎጂካዊ ስራሕ ኒውሮናት ኣዝዩ ዘይንቡር ምዃኑ የመልክት። ስለዚ፡ ኣብ ጽዑቕ ሴረቤላር ስላይስ (ስእሊ 2E) ምሉእ-ዋህዮ ፓች ክላምፕ ቅዳሓት ብምፍጻም፡ ኣብ 4 ክሳብ 5 ሰሙንን ካብ 7 ክሳብ 8 ሰሙንን ናይ OXPHOS-ጉድለት ዘለዎም ኒውሮናት ተሓላቒ ኤሌክትሪካዊ ባህርያት ተንቲንናዮ። ብዘይተጸበናዮ መንገዲ፡ ማእከላይ ናይ ዕረፍቲ ሽፋን ዓቕምን እታው ተጻዋርነትን ናይ Mfn2cKO ኒውሮናት ምስቲ ቁጽጽር ተመሳሳሊ እዩ ነይሩ፡ ዋላ እኳ ኣብ መንጎ ዋህዮታት ረቂቕ ፍልልያት እንተነበረ (ሰንጠረዥ 1)። ብተመሳሳሊ ካብ 4 ክሳብ 5 ሰሙን ዕድመ ኣብ ርክብ ዋሕዚ ኤሌክትሪክን ቮልቴጅን (IV curve) ዝኾነ ርኡይ ለውጢ ኣይተረኽበን (ስእሊ 2F)። ይኹን እምበር፡ ካብ 7 ክሳብ 8 ሰሙን ዝዕድሚኦም Mfn2cKO ኒውሮናት ካብቲ IV ስርዓት (ሃይፐርፖላራይዘሽን ስጉምቲ) ዝደሓኑ ኮይኖም፡ ኣብዚ ዳሕረዋይ ደረጃ ንሃይፐርፖላራይዘሽን ዓቕሚ ንጹር ተነቃፍነት ከምዘሎ ዘመልክት እዩ። ብኣንጻሩ ኣብ Mfn2cKO ኒውሮናት፡ እቶም ተደጋጋሚ ተግባር ዓቕሚ (AP) ምፍሳስ ዝፈጥሩ ዲፖላራይዚንግ ዋሕዚታት ብጽቡቕ ተጻዋርነት ኣለዎም፡ እዚ ድማ ሓፈሻዊ ምፍሳስ ቅዲኦም ካብ ናይ 8 ሰሙን ዝዕድሚኦም ቁጽጽር ኒውሮናት ርኡይ ፍልልይ ከምዘይብሉ የመልክት (ሰንጠረዥ 1ን ስእሊ 2Gን)። ብተመሳሳሊ ድግግምን ምልክትን ስፖንታይን ፖስትሲናፕቲክ ዋሕዚ (sPSCs) ምስቲ ናይቲ ቁፅፅር ጉጅለ ዝመጣጠን ኮይኑ፡ ድግግም ፍጻመታት ካብ 4 ሰሙን ናብ 5 ሰሙን ናብ 7 ሰሙን ክሳብ 8 ሰሙን ብተመሳሳሊ ወሰኽ ወሲኹ (ስእሊ 2፣ Hን Iን)። እቲ ናይ ሲናፕቲክ ብስለት ኣብ ፒኤን (25)። ድሕሪ ነዃላት ፒኤንስ ፓች ተመሳሳሊ ውፅኢት ተረኺቡ። እዚ ቅርጺ እዚ ከምቲ ኣብ ምዝገባ ምሉእ ዋህዮ ፓች ክላምፕ ከጋጥም ዝኽእል ናይ ዋህዮኣዊ ኤቲፒ ጉድለታት ክኸውን ዝኽእል ካሕሳ ይከላኸል። ብፍላይ ድማ ናይ ዕረፍቲ ሽፋን ዓቕምን ስፖንታይን ምትኳስ ፍሪኩዌንሲን ናይ Mfn2cKO ኒውሮናት ኣይተተንከፈን (ስእሊ 2, J and K)። ብሓፈሻ እዞም ውጽኢታት ርኡይ ናይ ኦክስፎስ ምዝንባዕ ዘለዎም ፒኤን ንልዑል ፍሪኩዌንሲ ፍሰት ቅዲ ብጽቡቕ ክጻወሩ ከም ዝኽእሉ ዘመልክቱ ኮይኖም፡ እዚ ድማ ዳርጋ ንቡር ኤሌክትሮፊዚዮሎጂካዊ ምላሽ ክዕቅቡ ዘኽእሎም ናይ ካሕሳ ኣገባብ ከምዘሎ የመልክት።
መረዳእታታት ብማእኸላይ ± SEM (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፣ ናይ ሆልም-ሲዳክ ብዙሕ ምውድዳር ፈተና፤ *P<0.05) ይግለፁ። ቁጽሪ ኣሃዱ ብሓጹር ይምልከት።
ዝኾነ ምድብ ኣብቲ ፕሮቲዮሚክስ ዳታሴት (ስእሊ 1G) ንኸቢድ ሕጽረት ኦክስፎስ ክቃወሙ ዝኽእሉ መንገድታት ዘጠቓልል እንተኾይኑ ንምምርማር ተበጊስና፣ በዚ ድማ ንምንታይ ዝተጸልወ ፒኤን ዳርጋ ንቡር ኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ክዕቅብ ከምዝኽእል ንገልጽ (ስእሊ 2፣ ካብ ካብ ካብ K ክሳብ K)። . ትንተና ፕሮቲዮሚክስ ከም ዘመልክቶ፡ ኣብ ካታቦሊዝም ጨንፈር ዘለዎም ሰንሰለታዊ ኣሚኖ ኣሲዳት (BCAA) ዝሳተፉ ኢንዛይማት ብዓቢኡ ንላዕሊ ከምዝተመሓደሩ (ስእሊ 3Aን ስእሊ S5Aን)፡ እቲ ናይ መወዳእታ ፍርያት ኣሲታይል-ኮኤ (CoA) ወይ ሱክሲኒል ኮኤ ድማ ኣብ ዑደት ኣርተሪዮስክለሮሲስ ኣሲድ (TCA) ንዝርከቡ ትራይካርቦክሳይሌት ክምልኡ ይኽእሉ። ትሕዝቶ BCAA transaminase 1 (BCAT1)ን BCAT2ን ክልቲኦም ከም ዝወሰኸ ረኺብናዮ። ካብ α-ketoglutarate (26) ግሉታሜት ብምፍራይ ነቲ ቀዳማይ ስጉምቲ BCAA catabolism catalyze ገይሮምዎ። ኩሎም ነቲ ጨንፈር ዘለዎ ሰንሰለት ኬቶ ኣሲድ ዲሃይድሮጂነዝ (BCKD) ኮምፕለክስ ዝፈጥሩ ንኡሳን ኣሃዱታት ንላዕሊ ይምራሕ (እቲ ኮምፕለክስ ነቲ ስዒቡ ዝመጽእን ዘይምለስን ዲካርቦክሳይለሽን ናይቲ ውጽኢት BCAA ካርቦን ዓጽሚ ይድርኽ) (ስእሊ 3Aን ስእሊ S5Aን)። ይኹን እምበር ኣብቲ ዝተሰርዐ ፒኤኤ ንባዕሉ ኣብ BCAA ዝኾነ ርኡይ ለውጢ ኣይተረኽበን፣ እዚ ድማ ብሰንኪ ምውሳኽ ዋህዮኣዊ ምውሳድ ናይዞም ኣገደስቲ ኣሚኖ ኣሲዳት ወይ ድማ ካልኦት ምንጭታት (ግሉኮስ ወይ ላክቲክ ኣሲድ) ብምጥቃም ንዑደት TCA ንምምላእ ክኸውን ይኽእል እዩ (ስእሊ S5B)። OXPHOS ዝጎደሎም PNs እውን ኣብ 8 ሰሙን ዕድመ ምውሳኽ ምብስባስ ግሉታሚንን ትራንስኣሚነሽን ንጥፈታትን ኣርእዮም፣ እዚ ድማ ብላዕለዋይ ምቁጽጻር ናይ ማይቶኮንድርያል ኢንዛይማት ግሉታሚነዝ (GLS)ን ግሉታሚን ፓይሩቫት ትራንስኣሚነዝ 2 (GPT2)ን ክግለጽ ይኽእል (ስእሊ 3፣ ሀን ሐን)። ኣብዚ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ እቲ ላዕለዋይ ምቁጽጻር GLS ኣብቲ spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) ዝተሓጽረ (ለውጢ Mfn2cKO/CTRL ብግምት 4.5-ዕጽፊ እዩ፣ P = 0.05)፣ ከምኡ’ውን ፍሉይ ምውሳኽ ምቁጽጻር ኣብ ቲሹታት መንሽሮ ማይቶኮንድርያል ባዮኢነርጂ ክድግፍ ይኽእል። (27)።
(ሀ) እቲ ናይ ሙቐት ካርታ ኣብ 8 ሰሙን ንዝተወሰነ መንገዲ ኣብ ደረጃ ፕሮቲን ዝረአ ናይ ዕጽፊ ለውጢ የርኢ። (B) ኣብነት ናይ ሴረቤላር ስላይስ ብጸረ-PCx ጸረ-ኣካል (scale bar, 20 μm) ዝተለጠፈ። እቲ ብጫ ፍላጻ ናብ ኣካል ዋህዮ ፑርኪንጀ የመልክት። (C) ናይ ግዜ መስርሕ ፕሮቲን መግለጺ ትንተና ከም ኣገዳሲ ሕጹይ ንኣተሮስክለሮሲስ (ብዙሕ t-test, *FDR <5%; n = 3-5 ኣእዋም) ተለልዩ። (D) ኣብ ላዕሊ፦ ኣብቲ [1-13C]ፓይሩቫት ትራሰር ዝርከብ ምልክት ዘለዎ ካርቦን (ማለት ብፒዲኤች ወይ ትራንስ-ኣርተርያል መንገዲ) ዝተፈላለዩ መገድታት ምእታው ዘርኢ ስኬማዊ ስእላዊ ስእሊ። ታሕቲ፡ ሰንጠረዥ ክራር፡ ንሕዱር ስላይስ ሴረቤላር ብ[1-13C]ፓይሩቬት (paired t-test; ** P <0.01) ድሕሪ ምልዋጥ፡ ናብ ኣስፓርቲክ ኣሲድ፡ ሲትሪክ ኣሲድን ማሊክ ኣሲድን ዝተቐየረ ሚእታዊት ብሚእታዊት ዘርኢ እዩ። (ሠ) ኩለመዳያዊ ትንተና ታሪኽ ግዜ ናይቲ ዝተጠቕሰ መንገዲ። ኣብ 8 ሰሙን P<0.05 ዘለዎም ፕሮቲናት ጥራይ ኣብ ግምት ኣእቱ ። ስርዝ ድልዝ ዝበለ መስመር: ናይ ምትዕርራይ ዋጋ የለን (ክልተ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ * P <0.05፤ *** P <0.001)። መረዳእታ ብማእኸላይ±SEM ይግለፅ።
ኣብ ትንታነና፡ BCAA catabolism ሓደ ካብቶም ቀንዲ up-regulation pathways ኮይኑ ኣሎ። እዚ ሓቂ እዚ ኣብ ዑደት TCA ዝኣቱ መጠን ንፋስ ኣብ PN OXPHOS ዝጎደሎ ክቕየር ከም ዝኽእል ብትሪ ይሕብር። እዚ ንሓደ ዓቢ መልክዕ ናይ ኒውሮናል ሜታቦሊክ ዋይሪሪንግ ክውክል ይኽእል እዩ፣ እዚ ድማ ኣብ እዋን ምዕቃብ ከቢድ ምዝንባዕ ኦክስፎስ ኣብ ኒውሮናል ፊዚዮሎጂን ብህይወት ምንባርን ቀጥታዊ ጽልዋ ክህልዎ ይኽእል። ምስዚ ግምታዊ መርትዖ ዝሰማማዕ፡ እቲ ቀንዲ ጸረ-ኣተሮስክለሮቲክ ኢንዛይም PCx up-regulated (Mfn2cKO/CTRL ብግምት 1.5 ግዜ ይቕየር፤ ስእሊ 3A) ምዃኑ ረኺብናዮ፡ እዚ ድማ ምቕያር ፓይሩቫት ናብ oxaloacetate (28) ዝድርኽ ኮይኑ፡ እዚ ድማ ኣብ ቲሹ ሓንጎል ከም ዘሎ ይእመን The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). ምስ ውጽኢት ፕሮቲዮሚክስ ዝሰማማዕ፡ ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ፡ PCx መግለጺ ብፍሉይን ብዓቢኡን ኣብ OXPHOS-ጉድለት PNs ከም ዝወሰኸ፡ PCx reactivity ብቐንዱ ኣብቶም ጎረባብቲ Bergmann glial ዋህዮታት ናይቲ ቁጽጽር ዝተሓጽረ ምዃኑ ኣርእዩ (ስእሊ 3B)። ነቲ ዝተዓዘብናዮ upregulation ናይ PCx ብተግባር ንምፍታን፡ ንሕዱር ሴሬቤላር ስላይስ ብ[1-13C]pyruvate tracer ሓኪምናዮ። ፓይሩቫት ብፓይሩቫት ዲሃይድሮጂነዝ (PDH) ኦክሳይድ ምስ ተገብረ፡ ናይ ኣይሶቶፕ ምልክትኡ ጠፊኡ , ግን ፓይሩቫት ብቫስኩላር ምላሽ ክመሓላለፍ ከሎ ኣብ TCA ዑደት መንጎኛታት ይሕወስ (ስእሊ 3D)። ንናይ ፕሮቲዮሚክስ ዳታና ንምድጋፍ፡ ካብዚ ትራሰር ኣብ ኣስፓርቲክ ኣሲድ ናይ Mfn2cKO ስላይስ ብብዝሒ ምልክታት ተዓዚብና፡ ሲትሪክ ኣሲድን ማሊክ ኣሲድን እውን ማእከላይ ዝንባለ ነይርዎም፡ ዋላ እኳ ትርጉም ዘለዎ እንተዘይኮነ (ስእሊ 3D)።
ኣብቶም ብፍሉይ ንማይቶኮንድርያል ትራንስክሪፕሽን ፋክተር ኤ ጂን (Tfam) ዘጥፍኡ ዶፓሚን ኒውሮናት ዝፈጠሮ ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ዘለዎም ኣእዋም ማይቶፓርክ ኣእዋም (ስእሊ S6B)፡ መግለጺ PCx እውን ብዓቢኡ ንላዕሊ ከምዝተመሓደረ (31)፡ እዚ ድማ ኣሲቶን ኣሲድ ኣርተሪዮስክለሮሲስ ምኽሳት ናይቲ ሕማም ኣብ እዋን ምዝንባዕ ስርዓተ-ምሕደራ ኒውሮናዊ ከምዝተመሓደረ የመልክት። ኦክስፎስ ኣብ ኣካላት። ኣብዚ ምስ ኣርተሪዮስክለሮሲስ ክተሓሓዙ ዝኽእሉ ኒውሮናት ክግለጹ ዝኽእሉ ፍሉያት ኢንዛይማት (32-34) ኣብ OXPHOS ዝጎደሎም PNs ብዓቢኡ ንላዕሊ ከምዝተመሓደሩ ተረጋጊጹ ኣሎ፣ ከም ፕሮፒዮኒል-ኮኤ ካርቦክሳይለዝ (PCC-A)፣ ማሎኒል-ኮኤ ንፕሮፒዮኒል-ኮኤ ናብ ሱክሲኒል-ኮኤን ማይቶኮንድርያል ማሊክ ኢንዛይም 3 (ME3)ን ይቕይሮ። ቀንዲ ተራኦም ፓይሩቫት ካብ ማሌት ምምላስ እዩ (ስእሊ 3፣ ሀን ሐን) (33, 35)። ብተወሳኺ፡ ኣብቲ ፎስፎርላይት ዝገብርን በዚ ኸኣ ንፒዲኤች ዘይንጡፍ ዝገብሮን Pdk3 ኢንዛይም ርኡይ ወሰኽ ረኺብና ( 36 )፡ ኣብቲ ንፒዲኤች ዘንቀሳቕስ Pdp1 ኢንዛይም ወይ ንባዕሉ ፒዲኤች ኢንዛይም ኮምፕለክስ ዝኾነ ለውጢ ኣይተረኽበን (ስእሊ 3ሀ)። ብቐጻሊ፡ ኣብ Mern2cKO PNs፡ ፎስፎርላይዜሽን ናይቲ α1 ንኡስ ኣሃዱ α (PDHE1α) ንኡስ ኣሃዱ ናይቲ pyruvate dehydrogenase E1 ባእታ ናይቲ PDH complex ኣብ Ser293 (ንጥፈት ኢንዛይም PDH ከም ዝዓግት ዝፍለጥ) ተዓብሊሉ (ስእሊ S6C) (ስእሊ S6C)። ፓይሩቫት ቫስኩላር መእተዊ የብሉን።
ኣብ መወዳእታ፡ እቲ ሱፐር መንገዲ ናይ ሴሪንን ግላይሲንን ባዮሲንተሲስ፡ እቲ ተዛማዲ ማይቶኮንድርያል ፎሌት (1C) ዑደትን ፕሮሊን ባዮሲንተሲስን (ስእሊ 1Gን ስእሊ S5Cን) ኩሎም ብዓቢኡ ንላዕሊ-ምምራሕ ከም ዘለዎም ረኺብናዮ፡ ብመሰረት ጸብጻባት፡ ኣብ እዋን መስርሕ ምንቅስቓስ። ኣብ ከባቢኦም ዝርከቡ ቲሹታት ብናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ ይንቀሳቐሱ (5-7)። ነዞም ፕሮቲዮሚክስ ዳታ ዝድግፍ ኮንፎካል ትንተና ከም ዘመልክቶ፡ ኣብ PN ምስ OXPHOS ዝጎደለ፡ ሴረቤላር ስላይስ ናይ 8 ሰሙን ዝዕድሚኦም ኣእዋም፡ ንserine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2)፡ ቁልፊ ኢንዛይም ናይ ማይቶኮንድርያል ፎሌት ዑደት ተገይሩሉ። ርኡይ ናይ ሕማም ምክልኻል ምላሽ (ስእሊ S5D)። ኣብ 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, metabolic tracing experiments ብተወሳኺ up-regulation of serine and proline biosynthesis ኣረጋጊጾም፣ እዚ ድማ ዋሕዚ ካርቦን isoforms ናብ serineን prolineን ከም ዝወሰኸ የመልክት (ስእሊ S5E)። ብGLSን GPT2ን ዝድገፉ ግብረመልሲታት ንመስርሕ ግሉታሜት ካብ ግሉታሚንን ኣብ መንጎ ግሉታሜትን α-ኬቶግሉታሬትን ንዝፍጠር ትራንስኣሚነሽንን ተሓተትቲ ስለዝኾኑ፡ ምውሳኽ ምቁጽጻርኦም OXPHOS-deficient ኒውሮናት ዝያዳ ጠለብ ግሉታሜት ከምዘለዎም የመልክት , እዚ ድማ ንዝወሰኸ ባዮሲንተሲስ ፕሮሊን ንምዕቃብ ዝዓለመ ክኸውን ይኽእል (ስእሊ S5C)። ብኣንጻር እዞም ለውጥታት፡ ፕሮቲዮሚክ ትንተና ናይ ሴረቤላር ኣስትሮሳይት ካብ PN-ፍሉይ Mfn2cKO ኣእዋም እዞም መንገድታት (ንኹሎም ጸረ-ፐሮክሳይድ ሓዊሱ) ኣብ መግለጺ ርኡይ ለውጢ ከምዘይተቐየሩ ኣርእዩ፡ በዚ ኸኣ እዚ መቦሊክ ዳግመ-ኣንፈት ንዝተበላሸወ PN (ስእሊ S6, D ክሳብ G) ምሩጽ ምዃኑ ኣርእዩ።
ብሓጺሩ፡ እዞም ትንተናታት ኣብ ፒኤን ዝርከቡ ፍሉያት መንገድታት ምትሕውዋስ መግቢ ብግዝያዊ ምንቅስቓስ ኣዝዩ ዝተፈላለየ ቅዲታት ኣግሂዶም። ዋላ እኳ ዘይንቡር ስራሕ ኒውሮናል ማይቶኮንድርያል ብኣግኡ ኣተሮስክለሮሲስን 1C ሪሞዴሊንግን (ስእሊ 3Eን ስእሊ S5Cን) ከስዕብ ይኽእል እንተኾነ፣ ዋላ’ውን ኣብ መግለጺ Iን IVን ኮምፕለክሳት ክትግምቶ ዝከኣል ለውጢ፣ ኣብ ሴሪን ዲ ኖቮ ምትእኽኻብ ዝመጽእ ለውጢ ግን ኣብ ዳሕረዋይ ደረጃታት ጥራይ እዩ ተራእዩ። ምዝንባዕ ስራሕ ኦክስፎስ (ስእሊ 3Eን ስእሊ S5Cን)። እዞም ርኽበታት እዚኦም፡ እቲ ብጸቕጢ ዝመጽእ ማይቶኮንድርያል (1C ዑደት)ን ሳይቶፕላዝማዊ (serine biosynthesis)ን ምስ ምውሳኽ ኣተሮስክለሮሲስ ኣብ ዑደት TCA ብሓባር ምላሽ ብምሃብ፡ ንመተቦሊዝም ኒውሮን ዳግማይ ቅርጺ ዝህብሉ ተኸታታሊ መስርሕ ይገልጹ።
8 ሰሙን ዝዕድሚኦም OXPHOS ዝጎደሎም PNs ልዑል ፍሪኩዌንሲ ዘለዎ ናይ ምልዕዓል ንጥፈታት ክዕቅቡን ንናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ ንምኽሓስ ርኡይ ናይ መቦሊክ ዳግመ ምትእስሳር ክገብሩን ይኽእሉ። እዚ ርኽበት እዚ ኣብዚ ህሞት እዚ እውን እንተኾነ እዞም ዋህዮታት ንነርቭ ዲጀነሬሽን ንምድንጓይ ወይ ንምክልኻል ፍወሳዊ ምትእትታው ክረኽቡ ይኽእሉ እዮም ዝብል መሳጢ ተኽእሎ የልዕል። ረፋድ። ነዚ ተኽእሎ ብኽልተ ነጻ ምትእትታዋት ኢና ፈቲሕናዮ። ኣብቲ ቀዳማይ ኣገባብ፡ MFN2 ኣብ OXPHOS-deficient PNs ኣብ vivo ብመምረጺ ክግለጽ ምእንቲ፡ Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector ዲዛይን ጌርና (ስእሊ S7A)። MFN2 ዝሕብር AAVን ፍሎረሰንት ሪፖርተር ጂን mCherry (Mfn2-AAV)ን ኣብ መባእታዊ ባህልታት ኒውሮን ኣብ ቪትሮ ተረጋጊጹ፣ እዚ ድማ MFN2 ብCre-ዝምርኮስ ኣገባብ ክግለጽን ንሞርፎሎጂ ማይቶኮንድርያ ኣድሒኑን፣ በዚ ድማ ኣብ Mfn2cKO ኒውሮናት ኒውሮሙቴሽን ይከላኸል (ስእሊ S7, B, D and E)። ቀጺልና፡ ን8 ሰሙን ዝዕድሚኦም Mfn2-AAV ናብ ሴረቤላር ኮርተክስ Mfn2cKOን ቁጽጽር ዝገበሩ ኣእዋምን ብስቴሪዮታክቲካዊ ኣገባብ ንምብጻሕ ኣብ vivo ፈተነታት ኣካይድና፡ ን12 ሰሙን ዝዕድሚኦም ኣእዋም ድማ ተንቲንናዮም (ስእሊ 4A)። እቶም ዝተሓከሙ Mfn2cKO ዝበሃሉ ኣእዋም ሞይቶም (ስእሊ 1፣ ሀን ለ) (16)። ቫይራል ትራንስዳክሽን ኣብ vivo ውጽኢቱ ምሩጽ መግለጺ PN ኣብ ገለ ሴረቤላር ዓንኬላት (ስእሊ S7, G and H)። መርፍእ ናይቲ mCherry (Ctrl-AAV) ጥራይ ዝገልጽ ቁጽጽር AAV ኣብ ደረጃ ምብስባስ ኒውሮ ኣብ እንስሳታት Mfn2cKO ርኡይ ጽልዋ ኣይነበሮን። ብኣንጻሩ፡ ትንተና ናይ Mfn2cKOs ብ Mfn2-AAV ዝተሰጋገሩ፡ ርኡይ መከላኸሊ ውጽኢት ናይቲ PN ዋህዮ ንጣብ ኣርእዩ (ስእሊ 4, B and C)። ብፍላይ ድማ ጽቕጥቕጥ ኒውሮን ካብቶም ቁጽጽር ዝገበሩ እንስሳታት ዳርጋ ዘይፍለ ይመስል (ስእሊ 4፡ Bን Cን፡ ከምኡ’ውን ስእሊ S7፡ Hን Iን)። መግለጺ MFN1 ግን ከኣ MFN2 ዘይኮነ ሞት ኒውሮን ኣብ ምድሓን ማዕረ ውጽኢታዊ እዩ (ስእሊ 4Cን ስእሊ S7ን፡ Cን Fን)፡ እዚ ድማ መግለጺ ካብ ማህጸን ወጻኢ ዝኾነ MFN1 ንሕጽረት MFN2 ብኣድማዒ መንገዲ ክምልእ ከም ዝኽእል ዘመልክት እዩ። ተወሳኺ ትንተና ኣብ ንጽል PN ደረጃ Mfn2-AAV ብዓቢኡ ንኣልትራስትራክቸር ማይቶኮንድርያ ከም ዘድሓነ፣ ደረጃታት mtDNA ንቡር ከም ዝገበረን ነቲ ልዑል መግለጺ ናይቲ ጸረ-ኣንጅዮጀነሲስ ምልክት PCx ከም ዝገላበጦን ኣርእዩ (ስእሊ 4, C to E)። ናይቶም ዝደሓኑ Mfn2cKO ኣእዋም ኣብ ናይ ዕረፍቲ ኩነታት ብዓይኒ ዝተገብረ መርመራ፡ ኣቃውሞኦምን ሞተር ምልክታትን (ምንቅስቓስ S1 ናብ S3) ከምዝተመሓየሸ ኣረጋጊጹ። ኣብ መደምደምታ፡ እዞም ፈተነታት ከም ዘመልክትዎ፡ ምድንጓይ ዳግመ-ምትእትታው MFN2 ናብቶም ኣብ OXPHOS ብኸቢድ ዝጎደሎም PNs፡ ንሃልኪ mtDNA ንድሕሪት ንምምላስን ንኣተሮስክለሮሲስ ንምልዕዓልን እኹል ምዃኑን፡ በዚ ድማ ኣብ vivo ምብስባስ ኣክሶንን ሞት ኒውሮንን ይከላኸል።
(ሀ) እቲ ዝተጠቕሰ መቦሊክ መንገዲ ምስ ዝንቀሳቐስ MFN2 ዝሕብር AAV ንምውጋእ ዝግበር ናይ ፈተነ መደብ ዘርኢ ስኬም። (B) ተወከልቲ ኮንፎካል ስእልታት ናይ 12 ሰሙን ዝዕድሚኦም ክፍልታት ሴረቤላር ኣብ 8 ሰሙን ብMfn2cKO ኣእዋም ዝተቐየሩን ብጸረ-ካልቢንዲን ጸረ-ኣካል ዝተለጠፉን። የማን፡ ምዕባይ ጽሕግታት ኣክሶን። ስኬል ናይቲ ኣክሶን ዙም 450ን 75 ማይክሮሜትን እዩ። (C) ጸጋም: ብዝሒ ጽቕጥቕጥ ዋህዮታት ፑርኪንጀ ኣብ AAV ትራንስዳክሽን ሉፕ (AAV+) (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ n = 3 ኣእዋም)። የማን: mtDNA ትኹረት ትንተና ኣብ transduced PN ኣብ ሰሙን 12 (unpaired t-test; n = 6 ዋህዮታት ካብ ሰለስተ ኣእዋም)። * P <0.05፤ ** ፒ <0.01። (D) ተወካሊ ምትሕልላፍ ኤሌክትሮን ማይክሮግራፍ ናይ PNs ናይ Mfn2cKO cerebellar ክፍልታት ምስ ዝተጠቕሱ ቫይራል ቬክተራት transduced. እቲ ሮዛ ማስክ ነቲ ብደንድራይት ዝተታሕዘ ከባቢ ዝገልጽ ኮይኑ፡ እቲ ብጫ ነጥቢ ዘለዎ ርብዒ መስመር ድማ ነቲ ብየማን ዝተዋህበ ዙም ዘርኢ እዩ፤ n ንኒውክለስ ይውክል። ስኬል ባር፣ 1μm። (E) ኣብ 12 ሰሙን ኣብ ዝተሰጋገረ PN ኣብነት PCx staining የርኢ። ስኬል ባር፣ 20μm። OE, ልዕሊ ዓቐን ምግላጽ፤ FC, ዕጽፊ ለውጢ።
ኣብ መወዳእታ፡ ኣብቶም OXPHOS dysfunction ዘጋጠሞም PNs ኣገዳስነት ፐሮክሳይድ-ዝተባህለ ዋህዮታት ብህይወት ምንባር መርሚርናዮ። ንሕና mCherry encoding AAV-shRNA (short hairpin RNA) ብፍላይ ንናይ ኣንጭዋ PCx mRNA (AAV-shPCx) ዒላማ ዝገበረ ፈጢርና፣ ነቲ ቫይረስ ወይ እቲ ዝተሓዋወሰ ቁጽጽሩ (AAV-scr) ድማ ኣብ ሓንጎል ናይ Mfn2cKO ኣእዋም ወጊእናዮ። እቲ መርፍእ ኣብ ራብዓይ ሰሙን ዕድመ (ስእሊ 5ሀ) ኣብቲ PCx expression ዝወሰኸሉ እዋን (ስእሊ 3C)ን PN cell layer ጌና ዘይተበላሸወሉ (ስእሊ 1A) ውፅኢታዊ PCx knockdown ንምርካብ ዝተገበረ እዩ። PCx ምውዳቕ (ስእሊ S8A) ንሞት PN ርኡይ ምቅልጣፍ ከምዘስዕብ ምፍላጥ ኣገዳሲ እዩ፣ እዚ ድማ እቲ እንኮ ዝተገደበ ቀለቤት ረኽሲ እዩ (ስእሊ 5፣ Bን Cን)። ንመካኒዝም ናይቲ ብPCx up-regulation ዝለዓዓል metabolic ጽልዋታት ንምርዳእ፡ ንሕና redox ኩነታት PNs ድሕሪ PCx knockdownን AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 ብሓንሳብ ተገሊጹ (ስእሊ S8, B ናብ D) glutathione ንምግምጋም ኣጽኒዕናዮ The relative change of peptide redox potential (38)። ድሕሪኡ፡ ድሕሪ FLIM ኩነታት ምርግጋጽ ኣብ ሳይቶፕላዝማዊ ሬዶክስ ኩነታት ክመጽእ ዝኽእል ለውጢ ንምፍላጥ ኣብ ጽዑቕ ሓንጎል ስላይስ ናይ 7 ሰሙን Mfn2cKO ወይ ቁጽጽር littermates ክልተ-ፎቶን ፍሎረሰንስ ዕድመ ምስሊ ማይክሮስኮፒ (FLIM) ኣካይድና። እቲ ትንተና ኣብ ሓደ Mfn2cKO PNs PCx መግለጺ ዝጎደሎ ናይ ኦክሳይድ ኩነታት ርኡይ ወሰኽ ኣርእዩ፣ እዚ ድማ ካብ ቁጽጽር ኒውሮናት ወይ Mfn2cKO PNs scrambled shRNA ጥራይ ዝገልጹ ዝተፈልየ እዩ (ስእሊ 5, D and E)። PCx expression down-regulated ኣብ ዝነበረሉ እዋን፡ ልዑል ኦክሳይድ ዝኾነ ኩነታት ዘርእዩ Mfn2cKO PNs ብሚእታዊት ብልዕሊ ሰለስተ ዕጽፊ ወሲኹ (ስእሊ 5E)፡ እዚ ድማ PCx up-regulation ናይ ዝተበላሸዉ ኒውሮናት ሬዶክስ ዓቕሚ ከም ዝዓቀበ የመልክት።
(ሀ) እቲ ዝተጠቕሰ መቦሊክ መንገዲ ምስ ዝንቀሳቐስ shPCx ዝሕብር AAV ንምውጋእ ዝግበር ናይ ፈተነ መደብ ዘርኢ ስኬም። (B) ተወከልቲ ኮንፎካል ስእልታት ናይ 8 ሰሙን ዝዕድሚኦም ክፍልታት ሴረቤላር ኣብ Mfn2cKO ኣእዋም ኣብ 4 ሰሙን ብጸረ-ካልሲንዩሪን ጸረ-ኣካል ዝተለወጡን ዝተለጠፉን። ስኬል ባር፣ 450μm። (C) ብዝሒ ጽቕጥቕጥ ዋህዮታት ፑርኪንጀ ኣብ AAV-transduced ሉፕስ (ሓደ-ኣንፈት ትንተና ፍልልይ፤ n = 3 ክሳብ 4 ኣእዋም)። መረዳእታታት ብማእኸላይ±SEM ይግለፁ፤ ***P<0.001 ዝብል እዩ። (D) ተወካሊ FLIM ስእሊ ማእከላይ ዕድመ ናይ 7 ሰሙን PN ዝገልጽ glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 ኣብ ትሕቲ ዝተወሰነ ናይ ፈተነ ኩነታት የርኢ። LUT (luok-up table) ratio: ናይ ምድሓን ግዜ ፍልልይ (ብፒኮሰከንድ)። ስኬል ባር፣ 25μm። (E) እቲ ሂስቶግራም ዝርገሐ Grx1-roGFP2 ዕድመ ክብርታት ካብ (D) (n=158 ክሳብ 368 ዋህዮታት ኣብ ክልተ ኣእዋም ኣብ ትሕቲ ነፍሲ ወከፍ ኩነታት) የርኢ። ኣብ ልዕሊ ነፍሲ ወከፍ ሂስቶግራም ዘሎ ፓይ ቻርት: ብዝሒ ናይቶም ብኣግባቡ ዝነውሐ (ቀይሕ፣ ኦክሳይድ) ወይ ዝሓጸረ (ሰማያዊ፣ ዝተቐነሰ) ዕድመ ዘለዎም ክብርታት ዋህዮታት የርኢ፣ እዚ ድማ ካብቲ ኣብ CTRL-AAV-scr ዘሎ ማእከላይ ዋጋ ዕድመ ካብ 1 SD ንላዕሊ እዩ። (F) እቲ ዝቐረበ ሞዴል መከላኸሊ ውጽኢት ምውሳኽ ምቁጽጻር ኒውሮናዊ ፒሲኤክስ ዘርኢ እዩ።
ብሓፈሻ ኣብዚ እንህቦ ዳታ ከም ዘመልክቶ፡ ዳግመ-ምግላጽ MFN2 ንዝማዕበለ PN ምስ ከቢድ ሕጽረት OXPHOS፡ ከቢድ ምውዳቕ mtDNA፡ ከምኡ’ውን ኣዝዩ ዘይንቡር ista ዝመስል ሞርፎሎጂ ምሉእ ብምሉእ ከድሕን ከም ዝኽእልን፡ በዚ ድማ ኣብ ምዕቡላት ሕማማት ከይተረፈ ቀጻሊ ምዕባለ ከም ዝህብን ይሕብር። ኒውሮዲጀነሬሽን ቅድሚ ሞት ዋህዮታት ዝነበረ ደረጃ ንድሕሪት ዝምለስ መርትዖ ይህብ። እዚ ደረጃ ናይ ምትሕውዋስ መግቢ ተዓጻጻፍነት ብዝያዳ ብዓቕሚ ኒውሮናት ንኣተሮስክለሮሲስ (ናይ TCA ዑደት ገመድ ምትእስሳር) ናይ ምልዕዓል ዓቕሞም ይጉልሕ፣ እዚ ድማ ኣብ OXPHOS ዝጎደሎም PNs ንመግለጺ PCx ይዓግትን ሞት ዋህዮታት የዕብዮን፣ በዚ ድማ መከላኸሊ ተራ ይጻወት (ስእሊ 5F)።
ኣብዚ መጽናዕቲ፡ ምላሽ ፒኤን ንኦክስፎስ ምዝንባዕ፡ በቲ ብመቦሊክ ፕሮግራማት ዝንቀሳቐስ ፍልልያዊ ምንቅስቓስ መንገዲ፡ ቀስ ብቐስ ናብ TCA ዑደት ኣተሮስክለሮሲስ ምቕራብ ምዃኑ መርትዖ ኣቕሪብና። ነቲ ፕሮቲዮሚክ ትንተና ብብዙሓት መመላእታ ኣገባባት ኣረጋጊጽናዮ፡ ብኸቢድ ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ኣብ ዝፈታተኑሉ እዋን፡ ኒውሮናት ቅድሚ ሕጂ ዘይፍለጥ መልክዕ ምትሕልላፍ መግቢ ከም ዘለዎም ኣቃሊዕና። እቲ ዝገርመና፡ ምሉእ መስርሕ ዋይሪንግ፡ ግድን ነቲ ንኒውሮዲጀነሬሽን ቀስ ብቐስን ብዘይምምላስን ዘሰንዮ መወዳእታ ሜታቦሊክ ኩነታት ምልክት ኣይኮነን፡ እንተኾነ ግን ዳታና ከም ዝሕብሮ፡ ዋላ ኣብቲ ቅድሚ ሞት ዋህዮታት ዘሎ ደረጃ፡ ናይ ጽገና ኒውሮን ክፈጥር ከም ዝኽእል ይሕብር Functional compensation mechanism. እዚ ርኽበት እዚ፡ ኒውሮናት ኣብ ኣካላትና ርኡይ ደረጃ ናይ ምትሕውዋስ ፕላስቲሲቲ ከም ዘለዎም ይሕብር። እዚ ሓቂ እዚ፡ ድሒሩ ዳግማይ ምትእትታው MFN2 ንመግለጺ ቁልፊ መተቦሊክ ምልክታት ንድሕሪት ክመልሶን ምብስባስ PN ክከላኸልን ከም ዝኽእል ዘረጋግጽ እዩ። ብኣንጻሩ፡ ንኣተሮስክለሮሲስ ይዓግቶን ንነርቭታት የቀላጥፎን። ትራንስሴክሹዋል።
ሓደ ካብቲ ኣብ መጽናዕትና ዝረኸብናዮ ኣዝዩ መሳጢ ርኽበታት፡ OXPHOS ዝጎደሎም PNs፡ ብፍሉይ ንኣርተሪዮስክለሮሲስ ዘነቓቕሑ ኢንዛይማት ንላዕሊ ብምምሕያሽ፡ ንመተቦሊዝም ዑደት TCA ክቕይርዎ ከም ዝኽእሉ እዩ። ዳግመ-ምትዕርራይ ምትሕውዋስ መግቢ ልሙድ ባህሪ ናይ ዋህዮታት መንሽሮ ኮይኑ፡ ገለ ካብኣቶም ኣብ ግሉታሚን ተጸጊዖም TCA ዑደት መንጎኛታት ብምምላእ ምጉዳል መመዘኒታት ንምፍራይ፡ እዚ ድማ ንሰንሰለት ስርዓተ ምስትንፋስ ዝድርኹን ምፍራይ ሽኮርን ኒውክሊዮታይድን ባዮሲንተሲስ ቅድመ-ተኸተልቲ ዝዕቅቡን እዮም (39 , 40)። ኣብ ቀረባ እዋን ዝተገብረ መጽናዕቲ ከም ዘመልክቶ፡ ኣብቶም OXPHOS ምዝንባዕ ዘጋጥሞም ዙርያዊ ቲሹታት፡ ዳግመ ምትእስሳር ምትሕልላፍ ግሉታሚን/ግሉታሜት እውን ጐሊሑ ዝረአ ባህሪ እዩ (5, 41)፡ ኣብዚ ኣንፈት ምእታው ግሉታሚን ናብ ዑደት TCA ኣብ Because of the severity of OXPHOS injury (41) ይምርኮስ። ). ይኹን እምበር፡ ኣብ ኣካላትና ዘሎ ዝኾነ ተመሳሳልነት ኒውሮናዊ መቦሊክ ፕላስቲሲቲን ኣብ ትሕዝቶ ሕማም ክህልዎ ዝኽእል ተዛማድነትን ንጹር መርትዖ የለን። ኣብ ቀረባ እዋን ኣብ ዝተገብረ መጽናዕቲ ኣብ ውሽጢ መርመራ፡ ቀዳሞት ኮርቲካል ኒውሮናት ንኒውሮትራንስሚሽን ዝኸውን ግሉታሜት ፑል ከም ዘንቀሳቕሱ ተረጋጊጹ፡ በዚ ድማ ኣብ ትሕቲ መቦሊክ ጸቕጢ ኩነታት ኦክሲዳቲቭ ሜታቦሊዝምን ኣተሮስክለሮሲስን ከም ዘተባብዑ ተረጋጊጹ ( 42 ). ኣብ ትሕቲ ፋርማኮሎጂካዊ ምዕጋት ናይ TCA ዑደት ኢንዛይም ሱክሲኔት ዲሃይድሮጂነዝ፡ ፓይሩቫት ካርቦክሳይለሽን ኣብ ባህላዊ ሴረቤላር ግራኑል ኒውሮናት ምትእኽኻብ ኦክሳሎኣሴቴት ከም ዝሕሉ ይእመን ( 34 ). ይኹን እምበር፡ ፊዚዮሎጂካዊ ተዛማድነት ናይዞም ኣገባባት ምስ ቲሹ ሓንጎል (ኣተሮስክለሮሲስ ብቐንዱ ኣብ ኣስትሮሳይት ጥራይ ዝተሓጽረ ምዃኑ ዝእመነሉ) ገና ኣገዳሲ ፊዚዮሎጂካዊ ትርጉም ኣለዎ (43)። ኣብዚ ጉዳይ እዚ፡ ዳታና ከም ዘመልክቶ፡ ኣብ ኣካላት ብOXPHOS ዝተጎድኡ PNs ናብ BCAA degradationን pyruvate carboxylationን ክቕየሩ ይኽእሉ፡ እዚኦም ድማ እቶም ክልተ ቀንዲ ምንጪታት መመላእታ TCA pool intermediates እዮም። ዋላ እኳ እቲ ግምታዊ ኣበርክቶ BCAA ካታቦሊዝም ኣብ ኒውሮናዊ ጸዓት ምትሕልላፍ ሓሳብ እንተቐረበ፡ ብዘይካ ተራ ግሉታሜትን GABAን ንኒውሮትራንስሚሽን ( 44 )፡ ክሳብ ሕጂ ነዞም ኣገባባት ኣብ vivo ዝኾነ መርትዖ የለን። ስለዚ፡ ዲስፋንክሽን ፒኤንስ፡ ነቲ ብመስርሕ ኣሲሚለሽን ዝድረኽ ሃልኪ ቲሲኤ ኢንተርሚድየትስ ብኣውቶማቲክ ኣተሮስክለሮሲስ ብምውሳኽ ክኽሕስዎ ከም ዝኽእሉ ምግማት ቀሊል እዩ። ብፍላይ ድማ፡ ንዝያዳ ጠለብ ኣስፓርቲክ ኣሲድ ንምዕቃብ፡ upregulation of PCx ከድሊ ይኽእል እዩ፡ እዚ ድማ ኣብ ምብዛሕ ዋህዮታት ምስ ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ተራእዩ እዩ ( 45 ). ይኹን እምበር፡ ትንተና ሜታቦሎሚክስና ኣብ Mfn2cKO PNs (ስእሊ S6A) ኣብ ደረጃ ርጉእ ኩነታት ኣስፓርቲክ ኣሲድ ዝኾነ ርኡይ ለውጢ ኣየቃልዐን፡ እዚ ድማ ኣብ መንጎ ዝበዝሑ ዋህዮታትን ድሕሪ ማይቶቲክ ኒውሮናትን ዝተፈላለየ ሜታቦሊክ ኣጠቓቕማ ኣስፓርቲክ ኣሲድ ዘንጸባርቕ ክኸውን ይኽእል እዩ። ዋላ እኳ ልክዕ ኣገባብ PCx upregulation ኣብ dysfunctional ኒውሮናት ኣብ vivo ገና መለለዪኡ, እዚ ቅድሚ ግዜኡ ምላሽ ኣብ ምዕቃብ redox ኩነታት ኒውሮናት ኣገዳሲ ተራ ከም ዘለዎ ኣርእይና፣ እዚ ድማ ኣብ FLIM ፈተነታት ኣብ cerebellar slices ተራእዩ። ብፍላይ ፒኤን ንፒሲኤክስ ንላዕሊ ከይቆጻጸሩ ምክልኻል ናብ ዝያዳ ኦክሳይድ ዝኾነ ኩነታት ከስዕብን ሞት ዋህዮታት ከቀላጥፍን ይኽእል። ምንቅስቓስ ምብስባስ BCAAን ካርቦክሳይለሽን ፓይሩቫትን ንናይ ዙርያ ቲሹታት ናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ መለለዪ ዝህቡ መንገድታት ኣይኮኑን (7)። ስለዚ፡ ዋላ’ውን ንኒውሮዲጀነሬሽን ኣገዳሲ ዝኾነ እንኮ ባህሪ እንተዘይኮይኑ፡ ቀዳምነት ዝወሃቦም ባህሪ ናይቶም ኦክስፎስ ዝጎደሎም ኒውሮናት ይመስሉ። .
ሕማም ሴረቤላር ዘይተመሳሳሊ ዓይነት ኒውሮዲጀነሬቲቭ ሕማም ኮይኑ መብዛሕትኡ ግዜ ከም ኣታክስያ ዝግለጽን መብዛሕትኡ ግዜ ንፒኤን ዝጎድእን እዩ (46)። እዚ ናይ ኒውሮን ህዝቢ ብፍላይ ንናይ ማይቶኮንድርያል ምዝንባዕ ተቓላዓይ እዩ ምኽንያቱ ኣብ ኣእዋም ዝገብርዎ ምሩጽ ምብስባስ ንብዙሓት ካብቶም ንናይ ሰብ ስፒኖሴረቤላር ኣታክስያ ዝገልጹ ሞተር ምልክታት ንምብዛሕ እኹል እዩ (16, 47, 48)። ብመሰረት ጸብጻባት፡ ትራንስጀኒክ ሞዴል ኣንጭዋ ምስ ምልዋጥ ጂን ምስ ሰብኣዊ ስፓይኖሴረቤላር ኣታክስያ ዝተኣሳሰር ኮይኑ፡ ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያል ኣለዎ ( 49 , 50 )፡ እዚ ድማ ሳዕቤናት ሕጽረት ኦክስፎስ ኣብ ፒኤንፒኤች ምጽናዕ ኣገዳሲ ምዃኑ የጉልሕ። ስለዚ ብፍላይ ነዚ ፍሉይ ዝኾነ ህዝቢ ኒውሮን ብኣድማዒ መንገዲ ንምንጻልን ንምጽናዕን ምቹእ እዩ። ይኹን እምበር፡ ፒኤን ንጸቕጢ ኣዝዮም ተሃዋስያን ትሑት ብዝሒ ካብ ምሉእ ህዝቢ ዋህዮታት ሴረቤላር ከም ዝሓዙን ኣብ ግምት ብምእታው፡ ንብዙሓት ኣብ ኦሚክስ ዝተመርኮሱ መጽናዕትታት፡ ከም ምሉእ ዋህዮታት ብመምረጺ ምፍላይ ገና በዳሂ መዳይ እዩ። ዋላ እኳ ዳርጋ ፍጹም ሕጽረት ብከላ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት (ብፍላይ ዓበይቲ ቲሹታት) ክትበጽሕ ዘይከኣል እንተኾነ፡ ንሕና ምስ FACS ውጽኢታዊ ናይ ምፍንጫል ስጉምቲ ኣወሃሂድና እኹል ቁጽሪ ተግባራዊ ኒውሮናት ንታሕቲ ፕሮቲዮሚክስ ትንተና ንምርካብ, ከምኡ'ውን Quite ልዑል ፕሮቲን ሽፋን (ከባቢ 3000 ፕሮቲናት) ኣለና ምስ ህሉው ዳታ ስብስብ ናይ ምሉእ ሴረቤሉም (51) ክነጻጸር ከሎ. ንህላወ ምሉእ ዋህዮታት ብምዕቃብ፡ ኣብዚ እንህቦ ኣገባብ፡ ኣብ ማይቶኮንድርያ ኣብ ዝርከቡ መንገድታት ምትሕውዋስ መግቢ ዝመጽእ ለውጢ ንምፍታሽ ጥራይ ዘይኮነ፡ ኣብ ሳይቶፕላዝማዊ መዛኑኡ ዝመጽእ ለውጢ ንምፍታሽ የኽእለና፡ እዚ ድማ ንኣጠቓቕማ ምህብታም ምልክት ሽፋን ማይቶኮንድርያል ፍሉይ ንዓይነታት ዋህዮታት ዝምልእ እዩ እቲ ሓድሽ ኣገባብ ንብዝሒ ማይቶኮንድርያ ኣብ ዝተሓላለኹ ቲሹታት (52, 53)። እዚ እንገልጾ ኣገባብ ምስ መጽናዕቲ ዋህዮታት ፑርኪንጀ ዝተኣሳሰር ጥራይ ዘይኮነስ፡ ኣብ ዝኾነ ዓይነት ዋህዮ ብቐሊሉ ክውዕል ይኽእል፡ ኣብ ሕሙም ሓንጎል ንዝፍጠር ለውጢ ምምሕያሽ መግቢ ንምፍታሕ፡ ካልኦት ሞዴላት ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያ ሓዊሱ።
ኣብ መወዳእታ፡ ኣብዚ መስርሕ ዳግመ-ምትዕርራይ መግቢ፡ ነቶም ቀንዲ ምልክታት ጸቕጢ ዋህዮታት ምሉእ ብምሉእ ክገላብጦምን ምብስባስ ኒውሮን ክከላኸልን ዝኽእል መስኮት ፍወሳ ኣለሊና ኣለና። ስለዚ፡ ኣብዚ ተገሊጹ ዘሎ ተግባራዊ ትርጉም ናይቲ ገመድ ምትእስሳር ምርዳእ፡ ኣብ እዋን ምዝንባዕ ማይቶኮንድርያል ንህይወት ኒውሮን ንምዕቃብ ክግበር ዝኽእል ሕክምናታት መሰረታዊ ርድኢት ክህብ ይኽእል። ኣብ መጻኢ ኣብ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት ሓንጎል ኣብ ምትሕልላፍ ጸዓት ዝመጽእ ለውጢ ንምቑራጽ ዝዓለመ መጽናዕቲ፡ ተግባራዊነት ናይዚ መትከል ኣብ ካልኦት ሕማማት ስነ-ኣእምሮ ምሉእ ብምሉእ ንምግላጽ የድሊ።
ቅድሚ ሕጂ ማይቶፓርክ ዝበሃሉ ኣእዋም ተገሊጾም እዮም (31)። C57BL/6N ዝበሃሉ ኣእዋም ምስ loxP flanking Mfn2 ጂናት ኣቐዲሞም ተገሊጾም እዮም ( ​​18 ) ምስ L7-Cre ኣእዋም ድማ ተሰጋጊሮም እዮም ( ​​23 )። እቲ ውጽኢት ድርብ ሄተሮዛይጎስ ዘርኢ ብድሕሪኡ ምስ ሆሞዛይጎስ Mfn2loxP/Mfn2loxP ኣእዋም ተሳጊሩ ንMfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) Purkinje-specific ጂን knockouts ተፈጢሩ። ኣብ ንኡስ ጕጅለ ምጽንባር፡ እቲ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ኣለል (stop-mtYFP) ብተወሳኺ መስቀላት (20) ተኣታትዩ። ኩሎም ኣገባባት እንስሳታት ብመሰረት ኤውሮጳዊ፡ ሃገራውን ትካላውን መምርሒታት ዝተኻየዱ ኮይኖም፡ ብላንደሳምትፉርናተር ካብ ኡምዌልትን ቨርብራውቸርሹትዝን፡ ሰሜን ራይን-ዌስትፋልያ፡ ጀርመን ዝጸደቑ እዮም። ስራሕ እንስሳታት እውን ብመምርሒ ኤውሮጳዊ ፈደረሽን ማሕበራት ላቦራቶሪ ሳይንስ እንስሳታት ዝኽተል እዩ።
ድሕሪ ምፍንጫል ማህጸን ናይታ ነፍሰጾር ሰበይቲ መደንዘዚ፡ ድቂ ኣንጭዋ ይንጸል (E13)። እቲ ኮርተክስ ብ10 ሚሊ ሜትር ሄፐስ ዝተመላእ ናይ ሃንክስ ሚዛናዊ ጨው ፍታሕ (HBSS) ተቖሪጹ ፓፓይን (20 U/ml)ን ሲስተይንን (1μg/ml) ዝሓዘ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ተሓሊፉ። ነቲ ቲሹ ኣብ DMEM ምሕቃቕ) ብኢንዛይማዊ ምሕቃቕ መግቢ ምፍንጫል። Ml) ኣብ 37°C ን20 ደቓይቕ፣ ድሕሪኡ ብመካኒካዊ ኣገባብ ኣብ DMEM ብ10% ጽግያት ሴረም ከብቲ ዝተመላእካ ምፍሓር። ዋህዮታት ብፖሊላይሲን ዝተለበጡ ብርጭቆ ሽፋን ስሊፕ ብ2×106 ኣብ ሓደ 6 ሴንቲ ሜትር ባህሊ ዲሽ ወይ ብፅፍሒ 0.5×105 ዋህዮታት/ሴንቲ ሜትር 2 ንትንተና ምስሊ ተዘሪኦም እዮም። ድሕሪ 4 ሰዓታት እቲ ማእኸላይ 1% B27 መመላእታን 0.5 ሚሊ ሜትር ግሉታማክስን ዝሓዘ ኒውሮባሳል ሴረም ዘይብሉ ማእኸላይ ተተኪኡ። ብድሕሪኡ እቶም ኒውሮናት ኣብ ምሉእ እቲ ፈተነ ኣብ 37°Cን 5% CO2ን ተዓቂቦም፡ ኣብ ሰሙን ሓደ ግዜ ድማ ይምገቡ። ኣብ ውሽጢ መርመራ ዳግመ-ውህደት ንምልዕዓል፡ 3μl (24-well culture dish) ወይ 0.5μl (24-well culture dish) ወይ 0.5μl (24-well plate) ናይዚ ዝስዕብ AAV9 ቫይረስ ቬክተር ኣብ ካልኣይ መዓልቲ ኣብ vitro ንኒውሮናት ንምሕካም ተጠቒሙ፡ AAV9.CMV.PI.eGFP። WPRE.bGH (ኣድጂን፡ ቁጽሪ ካታሎግ 105530-AAV9) ከምኡ’ውን AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ኣድጀን፡ ቁጽሪ ካታሎግ 105545-AAV9)ን ይርከብዎም።
ናይ ኣንጭዋ Mfn1ን Mfn2ን መመላእታ ዲኤንኤ (ካብ Addgene ፕላስሚድ #23212ን #23213ን ብቕደም ተኸተል ዝተረኽበ) ኣብ C-terminus ብV5 መስርዕ (GKPIPNPLLGLDST) ምልክት ተገይሩሉ፣ ብመንገዲ T2A መስርዕ ድማ ምስ mCherry ኣብ ፍሬም ይሕወስ። Grx1-roGFP2 ካብ ሃይደልበርግ TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ዝተዋህበ ህያብ እዩ። ን tdTomato ካሴት ልምዳዊ ኣገባብ ክሎኒንግ ብምጥቃም ብምትካእ፡ እቲ ካሴት ናብ pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ዓንዲ ሕቖ (Addgene መወከሲ ቁጽሪ 28306) ንኡስ ክሎን ብምግባር pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5፡ pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5ን... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ቬክተራት። ተመሳሳሊ ስትራተጂ ንመቆጻጸሪ ቬክተር pAAV-CAG-FLEX-mCherry ንምፍጣር ተጠቒሙ። AAV-shPCx ህንጻ ንምፍጣር፡ ፕላስሚድ AAV ቬክተር (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) የድሊ፡ እዚ ድማ ነቲ shRNA ዝዓለመ shRNA PCx ዝዓለመ ዲኤንኤ መስርዕ ዝሓዘ እዩ (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ኣብ ትሕቲ ቁፅፅር U6 ፕሮሞተር mCherry ኣብ ትሕቲ ቁፅፅር CMV ፕሮሞተር ይጥቀም። ምፍራይ ሓገዝቲ ኤኤቪ ቬክተራት ብመሰረት መምርሒ ኣፍራዪ (ሴል ባዮላብስ) እዩ ተኻይዱ። ብሓጺሩ፡ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ብሓላፊ Transfection of 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry ዝሓዘ ናይ ምትሕልላፍ ፕላስሚድ ተጠቐም (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ወይ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ኮዲንግ ጂን፣ ከምኡ እውን ኮዲንግ AAV1 ካፕሲድ ፕሮቲንን ተሓጋጋዚ ፕሮቲንን መዐሸጊ ፕላስሚድ ፕላስሚድ፣ ካልሲየም ፎስፌት ሜላ ብምጥቃም። እቲ ዘይተጻረየ ቫይረስ ልዕሊ ማይ ብዑደት ፍሪዝ-ታው ኣብ ደረቕ በረድ/ኤታኖል መሕጸቢን ኣብ ፎስፌት ባፈርድ ሳላይን (PBS) ብላይዝድ ዋህዮታትን ተረኺቡ። እቲ ኤኤቪ ቬክተር ብዘይቀጻሊ ኣዮዲክሳኖል ግራድየንት ኣልትራሴንትሪፉጌሽን (24 ሰዓታት ኣብ 32,000 rpmን 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድን) ተጸሪጉ ብኣሚኮን ኣልትራ-15 ሴንትሪፉጋል ፍልተር ተጠቒሙ ተጠርኒፉ። ጂኖም ታይተር ናይ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ጂኖም ቅዳሕ (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ (54) እዩ ነይሩ, ብናይ ሓቂ ግዜ ብዝሒ PCR (qPCR) ዝተለክዐ -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ከምኡ’ውን AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ዝበሃሉ ምዃኖም ይፍለጥ።
ቀዳሞት ኒውሮናት ኣብ በረድ ዝሑል 1x PBS ተሓጺቦም፡ ፐለተድ ኮይኖም፡ ድሕሪኡ ኣብ 0.5% ትሪቶን ኤክስ-100 / 0.5% ሶድየም ዲኦክሲኮሌት/ፒቢኤስ ላይሲስ ባፈር ፎስፋተዝን ፕሮቲዝ ኢንሂቢተርን (ሮቸ) ዝሓዘ ሆሞጀኒዝድ ተገይሩ። ቁጽሪ ፕሮቲን ባይሲንኮኒኒክ ኣሲድ መርመራ (Thermo Fisher Scientific) ብምጥቃም እዩ ተኻይዱ። ብድሕሪኡ እቶም ፕሮቲናት ብSDS-polyacrylamide gel electrophoresis ተፈላልዮም፡ ድሕሪኡ ኣብ ፖሊቪኒሊደን ፍሎራይድ ሽፋን (GE Healthcare) ተደሪጎም። ዘይፍሉያት ቦታታት ምዕጋትን ምስቲ ቀዳማይ ጸረ-ኣካል (ንዝርዝር ሓበሬታ ኣብ ሰሌዳ S1 ርአ) ኣብ 5% ጸባ ኣብ TBST (Tris-buffered saline with Tween)፣ ስጉምትታት ምሕጻብን ካልኣይ ጸረ-ኣካልን ኣብ TBST Incubate ምሕቃቕን። ምስ ቀዳማይ ጸረ-ኣካል ንሓደ ለይቲ ኣብ +4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምሕቃቕ። ድሕሪ ምሕጻብ ነቲ ካልኣዊ ጸረ-ኣካል ን2 ሰዓታት ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ምልካይ። ብድሕሪኡ ተመሳሳሊ ብሎት ምስ ጸረ-β-actin ጸረ-ኣካል ብምሕቃቕ ተመሳሳሊ ጽዕነት ተረጋጊጹ። ናብ ኬሚሉሚነሰንስ ብምቕያርን ኬሚሉሚነሰንስ ብምዕባይን (GE Healthcare) ምፍላጥ።
እቶም ቅድሚ ሕጂ ኣብ ብርጭቆ መሸፈኒ ስሊፕ ዝተዘርኡ ኒውሮናት ኣብቲ ዝተወሰነ ግዜ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን10 ደቓይቕ ብ4% ፓራፎርማልደሃይድ (PFA)/PBS ተቐሚጦም እዮም። እቶም መሸፈኒ ስሊፕ መጀመርያ ብ0.1% ትሪቶን ኤክስ-100/ፒቢኤስ ን5 ደቓይቕ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ይሰፍሩ፣ ድሕሪኡ ድማ ኣብ ብሎኪንግ ባፈር [3% ቦቪን ሴረም ኣልቡሚን (BSA)/PBS] ይሰርሑ። ኣብ ካልኣይ መዓልቲ እቶም ሽፋን ስሊፕ ብብሎኪንግ ባፈር ተሓፂቦም ምስቲ ዝምጥን ፍሎሮፎር-ኮንጁጌትድ ካልኣዊ ፀረ-ኣካል ን2 ሰዓታት ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ተሓቢኦም፤ ኣብ መወዳእታ፡ እቶም ናሙናታት ብ4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ብግቡእ ተሓጺቦም፡ ድሕሪኡ ኣብ ማይክሮስኮፕ ስላይድ ብኣክዋ-ፖሊ/ማውንት ተቐሚጦም።
ኣእዋም (ተባዕታይን ኣንስተይትን) ብውሽጢ ፐሪቶንያል መርፍእ ኬታሚን (130 ሚግ/ኪግ)ን ዛይላዚን (10 ሚግ/ኪግ)ን ተደኒሶም ብትሕቲ ቆርበት ብካርፕሮፈን መቐነሲ ቃንዛ (5 ሚግ/ኪግ) ተዋሂብዎም , ከምኡ’ውን ኣብ ውዑይ ፓድ ዝተዓጠቐ ስቴሪዮታክቲክ መሳርሒ (Kopf) ተቐሚጦም። ነቲ ርእሲ ምራኽ ኣቃሊዕካ ነቲ ምስ ሚስ ዓጽሚ ዝሰማማዕ ክፋል ሴረቤላር ኮርተክስ (ካብ ላምብዳ: ጭራ 1.8፡ ላተርያል 1፡ ምስ ሎቡላት IVን Vን ዝሰማማዕ) ንምቕራጽ ስኒ ድሪል ተጠቐም። ኣብ ታሕቲ ዘሎ ሰራውር ደም ንኸይትዕንቅፍ ኣብ ርእሲ ምራኽ ንእሽቶ ነዃል ንምፍጣር ዝጠወየ መርፍእ መርፍእ ተጠቐም። ብድሕሪኡ እቲ ቀጢን ዝተሳእለ ብርጭቆ ሻምብቆ ቀስ ኢሉ ናብቲ ማይክሮ-ጉድጓድ (ካብ -1.3 ክሳብ -1 ኣብ ቬንትራል ሸነኽ ናይቲ ዱራ ማተር) ይኣቱ፣ ካብ 200 ክሳብ 300 nl AAV ድማ ናብቲ ማይክሮ-ኢንጀክተር (Narishige) ብኢድ መርፍእ (Narishige) ብዙሕ ግዜ ብትሑት ጸቕጢ ኣብ ውሽጢ 10 ክሳብ 20 ደቓይቕ መስኮት ይውጋእ። ድሕሪ ምትሕልላፍ እቲ ቫይረስ ምሉእ ብምሉእ ንኽዝርጋሕ ነቲ ሻምብቆታት ደም ንተወሳኺ 10 ደቓይቕ ኣቐምጦ። እቶም ሻምብቆታት ደም ምስ ተሰሓቡ፡ እቲ ቆርበት ብጥንቃቐ ይስፈይ፡ እዚ ድማ ነድሪ ቁስሊ ንምንካይን እቲ እንስሳ ንኽሓዊን ይሕግዝ። እቶም እንስሳታት ድሕሪ እቲ መጥባሕቲ ንሓያሎ መዓልታት ብመቐነሲ ቃንዛ (ካስፖፈን) ተሓኪሞም፡ ኣብዚ ግዜ እዚ ኣካላዊ ኩነታቶም ብጥንቃቐ ተኸታቲሉ፡ ድሕሪኡ ኣብቲ ዝተገልጸ ግዜ ተቐቲሎም። ኩሎም ኣገባባት ብመሰረት ኤውሮጳዊ፡ ሃገራውን ትካላውን መምርሒታት ዝተኻየዱ ኮይኖም፡ ብላንደሳምትፉርናተር ካብ ኡምዌልትን ቨርብራውቸርሹትዝን፡ ሰሜን ራይን-ዌስትፋልያ፡ ጀርመን ዝጸደቑ እዮም።
እቶም እንስሳታት ብኬታሚን (100 ሚሊግራም/ኪግ)ን ዛይላዚንን (10 ሚሊግራም/ኪግ) ተደኒሶም፣ ልቢ ድማ መጀመርታ ብ0.1 ሜ ፒቢኤስ፣ ድሕሪኡ ድማ ብ4% ፒኤፍኤ ኣብ ፒቢኤስ ተሓዊሱ። እቲ ቲሹ ተቖሪጹ ኣብ 4% PFA/PBS ንሓደ ለይቲ ኣብ 4°C ተቐሚጡ። ካብቲ ጽኑዕ ሓንጎል ኣብ ፒቢኤስ ሳጂታል ክፍልታት (50 ማይክሮሜትር ርጉድ ዝበለ) ንምድላው ዝንቀጥቀጥ ካራ (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ተጠቒሙ። ብኻልእ መንገዲ እንተዘይተገልጸ፡ ምልካይ ነጻ ዝንሳፈፉ ክፍልታት ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ (13) ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐትን ምውጥዋጥን ተኻይዱ። ብሓፂሩ መጀመርያ እቶም ዝተረኸቡ ስላይስ ብ0.5% ትሪቶን ኤክስ-100/ፒቢኤስ ን15 ደቓይቕ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ተሰጋጊሮም፤ ንገለ ኤፒቶፕስ (Pcx and Shmt2)፣ ብ ኣብ tris-EDTA buffer ኣብ 80°C (PH 9) ኣብ ክንዲ እዚ ስጉምቲ ን25 ደቓይቕ ነቶም ስላይስ ኣውዕዮም። ቀጺሎም እቶም ክፍልታት ምስ ቀዳማይ ጸረ-ኣካል (ሰንጠረዥ S1 ርአ) ኣብ ምዕጋት መከላኸሊ (3% BSA/PBS) ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ንሓደ ለይቲ ምስ ምውጥዋጥ ተሓቢኦም እዮም። ንጽባሒቱ እቶም ክፍልታት ብብሎኪንግ ባፈር ተሓጺቦም ምስቲ ዝምጥን ፍሎሮፎር-ኮንጁጌትድ ካልኣዊ ጸረ-ኣካል ን2 ሰዓታት ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ተሓቢኦም፤ ኣብ መወዳእታ፡ እቶም ክፍልታት ብPBS ብግቡእ ተሓጺቦም፡ ብDAPI ጸረ-ተለኺዮም፡ ድሕሪኡ ብAquaPolymount On a microscope slide ተቐሚጦም።
ነቲ ናሙና ንምስኣል ብጻዕዳ ብርሃን ሌዘርን 405 ዳይኦድ ኣልትራቫዮሌት ሌዘርን ዝተዓጠቐ ሌዘር ስካኒንግ ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ (TCS SP8-X ወይ TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ተጠቒሙ። ነቲ ፍሎሮፎር ብምሕጓስን ነቲ ምልክት ብሃይብሪድ ዲቴክተር (HyDs) ብምእካብን፡ LAS-X ሶፍትዌር ምስ ናይክዊስት ናሙና ዝሰማማዕ ዝተደራረቡ ምስልታት ብተኸታታሊ ሞድ ንምእካብ ተጠቒሙ: ንዘይብዝሒ ፓነላት፡ ኣዝዩ ዳይናሚክ ምልክታት እዩ (ንኣብነት፡ ኣብ ሶማቲክ ዋህዮታትን ደንድራይትን) mtYFP) ኣብ BrightR ሞድ ብዝሒ ፒኤን ንምፍላጥ HyD ተጠቐም)። ድሕረ ባይታ ንምንካይ ካብ 0.3 ክሳብ 6 ns ዝበጽሕ ጌቲንግ ይግበር።
ኣብ ሓቀኛ ግዜ ምስሊ ናይ ዝተሰርዑ ዋህዮታት። ድሕሪ ምፍላይ ኣብ 1% B27 መመላእታን 0.5 mM GlutaMaxን ዝሓዘ Neurobasal-A medium ዋህዮታት ብቕጽበት ኣብ poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) , ድሕሪኡ ድማ እቶም ዋህዮታት ንኽሰፍሩ ኣብ 37°Cን 5% CO2ን ን1 ሰዓት ተቐሚጦም። ኣብ ሓቀኛ ግዜ ምስሊ ብጻዕዳ ሌዘር፣ HyD፣ 63×[1.4 ቁጽራዊ ኣፐርቸር (NA)] ዘይቲ ዕላማ ሌንስን ምውዓይ መድረኽን ዝተዓጠቐ Leica SP8 ሌዘር ስካኒንግ ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ እዩ ተኻይዱ።
እቲ ኣንጭዋ ብቕልጡፍ ብካርቦን ዳይኦክሳይድ ተደኒሱ ርእሱ ተቖሪጹ፣ ሓንጎሉ ብቕልጡፍ ካብ ርእሲ ምትካል ተኣልዩ፣ ኣብ 200μm ርጉድ ዝበለ (ን13C ምልክት ምግባር ፈተነ) ወይ 275μm ርጉድ ዝበለ (ንኽልተ ናይ ፎቶን ፈተነታት) ሳጂታል ክፍሊ ተቖሪጹ በዞም ዝስዕቡ ንዋት ዝተመልአ The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) በዞም ዝስዕቡ ንጥረ ነገራት ይምላእ: 125 ሚሊ ሜትር ዝሑል በረድ፣ ብካርቦን ዝተፀገበ (95% O2ን 5% CO2ን) ትሑት Ca2 + ኣርቲፊሻል ፈሳሲ ሓንጎል ዓንዲ ሕቖ (ACSF) NaCl፣ 2.5 ሚሊ ሜትር KCl፣ 1.25 ሚሊ ሜትር ሶድየም ፎስፌት መከላኸሊ፣ 25 ሚሊ ሜትር NaHCO3፣ 25 ሚሊ ሜትር ግሉኮስ፣ 0.5 ሚሊ ሜትር CaCl2ን... 3.5 ሚሊ ሜትር MgCl2 (ኦስሞቲክ ጸቕጢ ካብ 310 ክሳብ 330 ሚሊሞል)። ዝተረኸበ ስላይስ ሓንጎል ናብ ዝለዓለ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ሶድየም ፎስፌት ባፈር, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 and 2.0 mM MgCl2) ዝሓዘ ቅድሚ ምሕቃቕ ክፍሊ ኣሰጋግሮ። ማእከላይ) ፒኤች 7.4 ከምኡ’ውን ካብ 310 ክሳብ 320 ሚሊሞል)።
ኣብ መስርሕ ምስሊ፡ እቶም ስላይስ ናብ ውፉይ ክፍሊ ምስሊ ተሰጋጊሮም፡ እቲ ፈተነ ድማ ኣብ ትሕቲ ቀጻሊ ኤሲኤስኤፍ ፐርፉዥን ኣብ ቀዋሚ ሙቐት ካብ 32° ክሳብ 33 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተኻይዱ። ንስላይስ ምስሊ ብሌካ 25x ኦብጀክቲቭ ሌንስ (NA 0.95, ማይ) ዝተዓጠቐ ማልቲፎቶን ሌዘር ስካኒንግ ማይክሮስኮፕ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems)፣ Ti: ሳፋየር ሌዘር (Chameleon Vision II, Coherent) ተጠቒሙ። FLIM ሞዱል (ፒኮሃርፕ300፣ ፒኮኳንት)።
FLIM ናይ Grx1-roGFP2። ኣብ ሳይቶፕላዝማዊ ሬዶክስ ኩነታት ፒኤን ዝመጽእ ለውጢ ብኽልተ ፎቶን FLIM ኣብ ሳጂታል ሓንጎል ስላይስ ተለኪዑ፣ ኣብዚ Grx1-roGFP2 ባዮሰንሰር ንፒኤን ዒላማ ገይሩ። ኣብቲ ፒኤን ንጣብ፡ እቲ ናይ ምጥራይ ሜዳ ካብ ኣስታት 50 ክሳብ 80 ማይክሮሜትር ትሕቲ እቲ ስላይስ ገጽ ይምረጽ፡ እዚ ድማ ተግባራዊ ዝኾነ ፒኤን (ማለት ኣብ ጎኒ ደንድራይትስ ናይ ምልክት ቅርጺ ወይ ኒውሮናዊ ሞርፎሎጂ ለውጢ ዘይምህላው) ከምኡ’ውን ድርብ ኣወንታዊ roGFP2 ሴንሰርን AAV encoding shRNA PCx ወይ ናይ ቁጽጽር መስርዑ (ነፍሲ ወከፍ ብሓባር ዝገልጽ mCherry) ከምዘሎ ንምርግጋጽ እዩ። ንጽል-ስታክ ምስልታት ብ2x ዲጂታላዊ ዙም ምእካብ [ንውሓት ማዕበል ምልዕዓል: 890 ና.ሜ፤ 512 ና.ሜ 512 ፒክሰል]። ምልላይ፡ ውሽጣዊ HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] ከምኡ’ውን ኣብ ውሽጢ 2 ክሳብ 3 ደቓይቕ ብማእከላይ ገምጋም ምስሊ ብምእካብ እኹል ፎቶናት ከም ዝተኣከቡ (ብድምር 1000 ፎቶናት) ንcurve fitting ይጥቀሙ። ተነቃፍነት ናይቲ Grx1-roGFP2 መርማሪን ምርግጋጽ ኩነታት FLIMን፡ ኣብ ፐርፉዥን ACSF ኤክዞጀነስ 10 ሚሊ ሜተር H2O2 ኣብ ዝውሰኸሉ እዋን (ኦክሳይድ ምውሳኽ፡ ውጽኢቱ ድማ ዕድመ ምውሳኽ)፡ ድሕሪኡ ድማ 2 ሚሊ ሜትር ዲቲዮትረይቶል ብምውሳኽ (ደረጃ ምንካይ የጉድል፡ ውጽኢቱ ድማ ምንካይ)፡ ዋጋ ዕድመ roGFP2 ብምክትታል ተኻይዱ ኣብ ዕድመ) (ስእሊ S8, D ክሳብ G)። ነቲ ዝተረኽበ ውጽኢት ንምትንታን FLIMfit 5.1.1 ሶፍትዌር ተጠቐም፣ ነቲ ንጽል ኤክስፖነንሻል ምብስባስ መስመር ናይቲ ምሉእ ምስሊ ምስቲ ዝተዓቀነ IRF (መሳርሒ ምላሽ ተግባር) ምትእስሳር፣ χ2 ድማ ብግምት 1 እዩ።ዕድመ ሓደ PN ንምሕሳብ ኣብ ዙርያ ኣካል ነርቭ ዘሎ ማስክ ​​ብኢድ ተሳኢሉ፣ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ማስክ ዘሎ ማእከላይ ዕድመ ንቑጽሪ ተጠቒሙ።
ማይቶኮንድርያል ዓቕሚ ትንተና። እቲ ሕዱር ክፍሊ ብቐጥታ ኣብቲ ዝተሰነየ ACSF ዝተወሰኸ 100 nM TMRM ን30 ደቓይቕ ምስ ተሓበበ፡ ናይ PNs ናይ ማይቶኮንድርያል ዓቕሚ ለውጢ ብኽልተ ፎቶን ማይክሮስኮፕ ተለኪዑ። TMRM ምስሊ ነቲ መርማሪ ኣብ 920 ና.ሜ ብምንቕቓሕን ውሽጣዊ HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ብምጥቃም ምልክታት ብምእካብን እዩ ተኻይዱ፤ ተመሳሳሊ ናይ ምልዕዓል ማዕበል ንውሓት ብምጥቃም ግን ከኣ ዝተፈላለየ ውሽጣዊ HyD (FITC :525/50) ብምጥቃም mtYFP ምስሊ ንምሃብ። ብደረጃ ሓደ ዋህዮ ናይ ማይቶኮንድርያል ዓቕሚ ንምግምጋም ናይ ImageJ Image Calculator ፕላግ-ኢን ተጠቐም። ብሓጺሩ፡ እቲ ፕላግ-ኢን መመዓራረዪ: signal = min (mtYFP, TMRM) ነቲ TMRM ምልክት ብቋንቋ ፑርኪንጀ ሶማሊ ኣብቲ ንጽል-ስታክ ኮንፎካል ምስሊ ናይቲ ተዛማዲ ቻነል ዘርኢ ማይቶኮንድርያል ዞባ ንምልላይ ይጥቀመሉ። ድሕሪኡ ኣብቲ ውጽኢት ዝኾነ ማስክ ዘሎ ፒክሰል ስፍሓት ብቑጽሪ ይግለጽ፣ ድሕሪኡ ኣብቲ ተዛማዲ ደረት ንጽል-ስታክ ምስሊ ናይቲ mtYFP ቻነል ንቡር ብምግባር ነቲ ናይ ማይቶኮንድርያል ዓቕሚ ዘርኢ ናይ ማይቶኮንድርያል ክፋል ይረክብ።
እቲ ምስሊ ብሁይገንስ ፕሮ (ሳይንሳዊ ቮሉም ኢሜጅንግ) ሶፍትዌር ተፈቲሑ። ንዝተስካን ስእልታት ስርሓት ስርሓት ሸኽላ፡ ሞንታጅ ናይ ሓደ ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ስርሓት ድሕሪ ምዕቃን ምስሊ፡ ImageJን Adobe Photoshopን ተጠቒምካ ነቲ ምስሊ ብዝያዳ ንምስራሕን ድምቀትን ንጽጽርን ብሓደ ዓይነት መንገዲ ንምትዕርራይን። ንምድላው ግራፊክ ኣዶብ ኢሉስትሬተር ተጠቐም።
mtDNA ትኹረት ትንተና። ብዝሒ ቁስሊ mtDNA ኣብቶም ብጸረ-ኣካላት ኣንጻር DNA ብኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ዝተለጠፉ ክፍልታት ሴረቤላር ብቑጽሪ ተገይሩ። ነፍሲ ወከፍ ዕላማ ዝገበረ ከባቢ ንኣካል ዋህዮን ንኒውክለስ ነፍሲ ወከፍ ዋህዮን ዝተፈጥረ ኮይኑ፡ እቲ ዝምልከቶ ስፍሓት ድማ ብ Multi Measure plug-in (ImageJ software) ተጠቒምካ ተሰሊዑ። ነቲ ኒዩክለር ስፍሓት ካብ ከባቢ ኣካላት ዋህዮ ኣጉዲልካ ሳይቶፕላዝማዊ ስፍሓት ምርካብ። ኣብ መወዳእታ፡ ኣብቲ ደረት ምስሊ mtDNA ዘመልክቱ ሳይቶፕላዝማዊ ዲኤንኤ ነጥብታት ብኣውቶማቲክ ንምቑጻር፡ Analyze Particles plug-in (ImageJ software) ተጠቒሙ፡ እቲ ዝተረኽበ ውጽኢት ድማ ናብ PN ማእከላይ ደረጃ ናይ CTRL ኣእዋም ንቡር ኮይኑ። እቲ ውጽኢት ብማእከላይ ገምጋም ቁጽሪ ኒውክሊዮሳይድ ኣብ ሓደ ዋህዮ ይግለጽ።
ትንተና መግለጺ ፕሮቲን ። ኣብ ፒኤን ብደረጃ ንጽል ዋህዮ መግለጺ ፕሮቲን ንምግምጋም ናይ ImageJ Image Calculator plug-in ተጠቐም። ብሓጺሩ፡ ኣብቲ ንጽል-ንጣብ ኮንፎካል ምስሊ ናይቲ ተዛማዲ ቻነል፡ ብመንገዲ እቲ መመዓራረዪ: ምልክት = min (mtYFP, ጸረ-ኣካል)፡ እቲ ኣብ ፑርኪና ንዝተወሰነ ጸረ-ኣካል ኢሚዩኖሪኣክቲቪቲ ዘርኢ ማይቶኮንድርያል ዞባ ይልለ። ድሕሪኡ ኣብቲ ውጽኢት ዝኾነ ማስክ ዘሎ ፒክሰል ስፍሓት ብቑጽሪ ይግለጽ፣ ድሕሪኡ ኣብቲ ተዛማዲ ደረት ንጽል-ስታክ ምስሊ ናይቲ mtYFP ቻነል ንቡር ብምግባር ናይቲ ዝተራእየ ፕሮቲን ማይቶኮንድርያል ክፋል ይረክብ።
ትንተና ጽቕጥቕጥ ዋህዮታት ፑርኪንጀ። ንብዝሒ ዝተቖጽሩ ዋህዮታት ፑርኪንጀ ብ ንውሓት ናይቲ ብእቶም ዝተቖጽሩ ዋህዮታት ዝተሓዝአ ቀለቤት ሴረቤላር ብምክፋል ጽቕጥቕጥ ፑርኪንጀ ንምግምጋም ናይ ImageJ ዋህዮ ቆጻሪ ፕላግ-ኢን ተጠቒሙ።
ናሙና ምድላውን ምእካብን ። ካብቲ ቁጽጽር ጉጅለን Mfn2cKO ኣእዋምን ዝመጹ ሓንጎላት ኣብ 2% PFA/2.5% ግሉታራልደሃይድ ኣብ 0.1 M ፎስፌት መከላኸሊ (PB) ተቐሚጦም፣ ድሕሪኡ ድማ ሲልያትስ (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (ርጉድና ካብ 50 ክሳብ 60 ማይክሮሜትር) ተጠቒሞም ኮሮናል ክፍልታት ተዳልዮም ድሕሪኡ ኣብ PB መከላኸሊ ኣብ 1% ኦስ ቴትራኦክሳይድን... 1.5% ፖታስየም ፈሮሳይናይድ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን1 ሰዓት። እቶም ክፍልታት ብድስቲልድ ማይ ሰለስተ ግዜ ተሓፂቦም፣ ድሕሪኡ ብ1% ዩራኒል ኣሴቴት ዝሓዘ 70% ኤታኖል ን20 ደቓይቕ ተለኺዮም። ብድሕሪኡ እቶም ክፍልታት ኣብ ደረጃ ዘለዎ ኣልኮል ማይ ወጺኦም ኣብ Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) ኣብ መንጎ ሲሊኮን ዝተለበጠ ብርጭቆ ስላይድ ተሰዂዖም፣ ኣብ መወዳእታ ድማ ኣብ 60°C ኣብ ፎርኖ ን48 ሰዓታት ፖሊመርይዝ ተገይሩ። እቲ ከባቢ ሴረቤላር ኮርተክስ ተመሪጹ 50 ና.ሜ ዝዓቐኑ ኣዝዩ ቀጢን ክፍልታት ኣብ ሌካ ኣልትራካት (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ተቖሪጹ ኣብ 2×1 ሚ.ሜ ብፖሊስታይሪን ፊልም ዝተለበጠ ነሓስ ስሊት ግሪድ ተለቒሙ። እቶም ክፍልታት ብፍታሕ 4% ዩራኒል ኣሴቴት ኣብ H2O ን10 ደቓይቕ ተለኺዮም ብH2O ብዙሕ ግዜ ተሓጺቦም፣ ድሕሪኡ ብReynolds lead citrate ኣብ H2O ን10 ደቓይቕ ተሓጺቦም፣ ድሕሪኡ ብH2O ብዙሕ ግዜ ተሓጺቦም። ማይክሮግራፍ ብናይ ምትሕልላፍ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ ፊሊፕስ ሲኤም100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ብTVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 ዲጂታላዊ ካሜራ (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ተጠቒምካ ዝተወሰደ እዩ። ጀርመን)።
ብAAV ዝተለኽፉ ኣእዋም፡ ሓንጎል ተፈልዩ ናብ 1 ሚ.ሜ ርጉድ ዝበለ ሳጂታል ክፍሊ ተቖሪጹ፡ እቲ ሴሬቤሉም ድማ ብፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕ ተጠቒምካ ነቲ ብAAV ዝተለኽፈ ቀለቤት (ማለት mCherry expressing) ንምልላይ ተፈቲኑ። AAV መርፍእ ውጽኢቱ ኣዝዩ ልዑል ናይ ምትሕልላፍ ብቕዓት ናይ ፑርኪንጀ ዋህዮ ንጣብ (ማለት ዳርጋ ምሉእ ንጣብ) ብውሑዱ ኣብ ክልተ ተኸታተልቲ ቀለቤት ሴረቤላር ጥራይ እዮም ዝጥቀሙ። እቲ ብAAV ዝተሰጋገረ ሉፕ ንሓደ ለይቲ ድሕሪ ምትዕርራይ (4% PFAን 2.5% ግሉታራልደሃይድን ኣብ 0.1 M ኮኮት መከላኸሊ) ማይክሮዲሰክሽን ተገይሩሉ ተወሳኺ መስርሕ ተገይሩሉ። ንEPON embedding እቲ ጽኑዕ ቲሹ ብ0.1 M ሶድየም ኮኮት መከላኸሊ (Applichem) ተሓጺቡ፣ ምስ 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ድማ ኣብ 0.1 M ሶድየም ኮኮት መከላኸሊ (Applichem) 4 ሰዓታት ተሓጺቡ፣ ድሕሪኡ ን2 ሰዓታት ተሓጺቡ። ብ0.1 M ኮካማይድ መከላኸሊ 3 ግዜ ደግሞ። ብድሕሪኡ እቲ ዝዓርግ ተኸታታሊ ኤታኖል ንነፍሲ ​​ወከፍ ፍታሕ ኤታኖል ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን15 ደቓይቕ ብምሕቃቕ ነቲ ቲሹ ማይ ንምውሓድ ተጠቒሙ። እቲ ቲሹ ናብ ፕሮፒሊን ኦክሳይድ ተሰጋጊሩ ኣብ EPON (Sigma-Aldrich) ኣብ 4°C ንሓደ ለይቲ ተሓቢኡ። ነቲ ቲሹ ኣብ ፍሩይ ኢፖን ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ን2 ሰዓታት ኣቐምጦ፣ ድሕሪኡ ኣብ 62 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን72 ሰዓታት ስርዓዮ። ኣልትራማይክሮቶም (Leica Microsystems, UC6)ን ኣልማዝ ካራን (Diatome, Biel, Switzerland) ተጠቒምካ 70 ና.ሜ ኣዝዩ ቀጢን ክፍልታት ምቑራጽ፣ ብ1.5% ዩራኒል ኣሴቴት ድማ ን15 ደቓይቕ ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምልካይ፣ ብሊድ ሲትሬት ፍታሕ ድማ ን4 ደቓይቕ ምልካይ። እቶም ኤሌክትሮን ማይክሮግራፍ ብካሜራ ዋንቪው 4K 16-ቢት (ጋታን)ን ዲጂታልማይክሮግራፍ ሶፍትዌር (ጋታን)ን ዝተዓጠቐ JEM-2100 Plus ትራንስሚሽን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (JEOL) ተጠቒሞም ዝተወሰዱ እዮም። ንትንተና ድማ ኤሌክትሮን ማይክሮግራፍ ብ5000× ወይ 10,000× ዲጂታል ዙም ተረኺቡ።
ሞርፎሎጂካዊ ትንተና ማይቶኮንድርያ። ንኹሎም ትንተናታት፡ ቅርጺ ውልቀ-ማይቶኮንድርያ ብኢድ ኣብ ዲጂታላዊ ምስልታት ImageJ ሶፍትዌር ተጠቒሞም ተዘርዚሮም እዮም። ዝተፈላለዩ ሞርፎሎጂካዊ መለክዒታት ይትንተኑ። ጽቕጥቕጥ ማይቶኮንድርያ ንጠቕላላ ስፍሓት ማይቶኮንድርያ ነፍሲ ወከፍ ዋህዮ ብናይ ሳይቶፕላዝም ስፍሓት (ሳይቶፕላዝም ስፍሓት = ዋህዮ ስፍሓት-ዋህዮ ኒውክለስ ስፍሓት) × 100 ብምክፋል ብዝተረኽበ ሚእታዊት ይግለጽ።ክብብነት ማይቶኮንድርያ ብቀመር [4π∙(ስፍሓት/ከባቢ 2)] ይሕሰብ። ሞርፎሎጂ ኢስታ ማይቶኮንድርያ ተተንቲኑ ከከም ቀንዲ ቅርጾም ኣብ ክልተ ምድብ (“ቱቡላር”ን “ብሊስተር”ን) ተኸፋፊሉ።
ትንታነ ቁጽርን ጽቕጥቕጥን ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም። ኣብቲ ዲጂታላዊ ምስሊ ናይ ነፍሲ ወከፍ ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም ቅርጺ ብኢድካ ንምዝርዛር ImageJ ሶፍትዌር ተጠቐም። ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም ስፍሓት ንጠቕላላ ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም ስፍሓት ኣቃውማ ነፍሲ ወከፍ ዋህዮ ብናይ ሳይቶፕላዝም ስፍሓት (ሳይቶፕላዝም ስፍሓት=ዋህዮ ስፍሓት-ኒውክለስ ስፍሓት)×100 ብምምቃል ብሚእታዊት ይግለጽ። ጽቕጥቕጥ ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም ንጠቕላላ ቁጽሪ ብብዝሒ ኣውቶፋጎዞም/ላይሶዞም ኣቃውማታት ኣብ ሓደ ዋህዮ (ብመንጽር ሳይቶፕላዝማዊ ስፍሓት) (ሳይቶፕላዝማዊ ስፍሓት = ዋህዮ ስፍሓት-ኒዩክለር ስፍሓት) ብምክፋል ይሕሰብ።
ንሕዱር ምክፍፋልን ምድላው ናሙናን ምልክት ምግባር። ምልክት ግሉኮስ ንዘድልዮም ፈተነታት፡ ነቶም ጽዑቓት ስላይስ ሓንጎል ናብ ቅድሚ ምሕቃቕ ዝርከብ ክፍሊ ኣሰጋግሮም፡ እዚ ድማ ጽጉብ ካርቦን (95% O2ን 5% CO2ን)፡ ልዑል Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ሶድየም ፎስፌት መከላኸሊ፡ 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM ዝሓዘ እዩ። d-glucose, 1.0 mM CaCl 2 and 2.0 mM MgCl 2, ናብ pH 7.4ን 310 ክሳብ 320 mOsmን ዝተስተኻኸለ)፣ ኣብዚ ግሉኮስ 13 C 6- ምትኽኻእ ግሉኮስ (Eurisotop, catalog number CLM-1396) እዩ። ንፓይሩቫት ምልክት ምግባር ንዘድልዮም ፈተነታት፡ እቶም ጽዑቓት ስላይስ ሓንጎል ናብ ዝለዓለ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ሶድየም ፎስፌት ባፈር, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2ን ምውሳኽን ኣሰጋግሩ MgCl2፣ ናብ pH 7.4ን 310 ክሳብ 320mOsmን ኣስተኻኽል፣ ከምኡ’ውን 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, catalog number CLM-1082) ምውሳኽ። ነቶም ክፍልታት ን90 ደቓይቕ ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምሕቃቕ። ኣብ መወዳእታ ናይቲ ፈተነ፡ እቶም ክፍልታት ብቕልጡፍ ብ75 ሚሊ ሜትር ኣሞንየም ካርቦኔት ዝሓዘ ማይ ዝሓዘ ፍታሕ (pH 7.4) ተሓጺቦም፡ ድሕሪኡ ኣብ 40:40:20 (v:v:v) ኣሲቶኒትራይል (ACN): ሜታኖል: ማይ ሆሞጀኒዝ ተገይሮም እዮም። እቶም ክፍልታት ኣብ በረድ ን30 ደቓይቕ ምስ ተሓበቡ፡ እቶም ናሙናታት ኣብ 21,000 ግ ን10 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሮም፡ እቲ ንጹር ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ድማ ኣብ ስፒድቫክ ኮንሰንትሬተር ነቒጹ። እቲ ዝረኸብናዮ ዝነቐጸ መተቦላይት ሽጉርቲ ክሳብ ትንተና ኣብ -80 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተዓቂቡ።
ፈሳሲ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ ትንተና 13 C-labeled ኣሚኖ ኣሲዳት። ንፈሳሲ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ትንተና፡ እቲ መተቦላይት ሽጉርቲ ኣብ 75μl LC-MS ደረጃ ማይ (ሃኒዌል) ዳግማይ ተዓጽዩ። ድሕሪ ሴንትሪፉጌሽን ኣብ 21,000 ግ ን5 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ 20 ማይክሮሊትር ካብቲ ዝተነፀረ ልዕሊ ማይ ንኣሚኖ ኣሲድ ፍሉክስ ትንተና ክውዕል እንከሎ ዝተረፈ ቅብኣት ድማ ብቕጽበት ንኣንዮን ትንተና ተጠቒሙ (ኣብ ታሕቲ ርአ)። ትንተና ኣሚኖ ኣሲድ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ቤንዞይል ክሎራይድ ዲሪቫታይዜሽን ፕሮቶኮል (55, 56) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። ኣብ ቀዳማይ ደረጃ 10μl 100 ሚሊ ሜትር ሶድየም ካርቦኔት (ሲግማ-ኣልድሪች) ኣብ 20μl መተቦላይት ቅብኣት ተወሰኸሉ፣ ድሕሪኡ 10μl 2% ቤንዞይል ክሎራይድ (ሲግማ-ኣልድሪች) ኣብ LC ደረጃ ACN ተወሰኸ። እቲ ናሙና ንሓጺር እዋን ቮርቴክስ ተገይሩሉ ድሕሪኡ ኣብ 21,000 ግ ን5 ደቓይቕ ኣብ 20 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሩሉ። ነቲ ዝተጸረየ ልዕሊ ማይ ናብ 2 ሚሊ ሊትር ኣውቶሳምፕለር ፍንጃል ብኮኒካዊ ብርጭቆ ምትእትታው (200 μl ድምጺ) ኣሰጋግሮ። እቶም ናሙናታት ምስ Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ልዑል ርዝነት ዘለዎ ትኽክለኛ ማስ ስፔክትሮሜተር (Thermo Fisher Scientific) ዝተኣሳሰር Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) ተጠቒሞም እዮም ተተንቲኖም። ንትንተና 2μl ካብቲ ዝተረኸበ ናሙና ኣብ 100×1.0 ሚ.ሜ ልዑል ጥንካረ ዘለዎ ሲሊካ T3 ዓምዲ (ማይ) 1.8μm ንጥረ ነገራት ዝሓዘ ተወጊኡ። ፍሰት ዋሕዚ 100μl/ደቒቕ ኮይኑ፡ እቲ መከላኸሊ ስርዓት ድማ መከላኸሊ A (10 ሚሊ ሜትር ኣሞንየም ፎርሜትን 0.15% ፎርሚክ ኣሲድን ኣብ ማይ)ን መከላኸሊ B (ACN)ን ዝሓዘ እዩ። እቲ ምዕባለ ከምዚ ዝስዕብ እዩ፦ 0%B ኣብ 0 ደቓይቕ፤ 0%B. ካብ 0 ክሳብ 15% B ኣብ 0 ክሳብ 0.1 ደቓይቕ፤ ካብ 15 ክሳብ 17% B ኣብ 0.1 ክሳብ 0.5 ደቓይቕ፤ B ካብ 17 ክሳብ 55% ኣብ 0.5 ክሳብ 14 ደቓይቕ፤ B ካብ 55 ክሳብ 70% ኣብ 14 ክሳብ 14.5 ደቓይቕ፤ ኣብ 14.5 ክሳብ 70 ክሳብ 100% B ኣብ 18 ደቓይቕ፤ 100% B ኣብ 18 ክሳብ 19 ደቓይቕ፤ ካብ 100 ክሳብ 0% B ኣብ 19 ክሳብ 19.1 ደቓይቕ፤ 0% B ኣብ 19.1 ክሳብ 28 ደቓይቕ (55, 56)። እቲ QE-HF ማስ ስፔክትሮሜተር ብኣወንታ ኣዮናይዜሽን ሞድ ዝሰርሕ ኮይኑ ካብ m/z (ማስ/ቻርጅ ሬሽዮ) ካብ 50 ክሳብ 750 ዝበጽሕ ጅምላ እዩ።እቲ ዝትግበር ርዝነት 60,000 ኮይኑ፡ እቲ ዝተረኽበ ናይ መኽሰብ ቁጽጽር (AGC) ኣዮን ዕላማ ድማ 3×106 ኮይኑ፡ ዝለዓለ ናይ ኣዮን ግዜ ድማ 100 ሚሊሰከንድ እዩ። እቲ ውዑይ ኤሌክትሮስፕራይ ኣዮናይዜሽን (ESI) ምንጪ ብ3.5 ኪሎ ቮልት ረሳሕ ፈሳሲ፣ 250 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሙቐት ሻምብቆታት፣ 60 ኤዩ (ፍቓደኛ ኣሃዱታት) ዋሕዚ ኣየር ሸፋሽፍቲ፣ ከምኡ እውን ብሓጋዚ ዋሕዚ ኣየር 20 ኤው ይሰርሕ። 250 ዲግሪ ሰንቲግሬድ። እቲ S ሌንስ ኣብ 60 AU ተቐሚጡ ኣሎ።
ኣንዮን ክሮማቶግራፊ-MS ትንተና 13C ዝተለጠፉ ኦርጋኒክ ኣሲዳት። ዝተረፈ መተቦላይት ፕረሲፒቴት (55μl) ምስ QE-HF ማስ ስፔክትሮሜተር (Thermo Fisher Scientific) ዝተኣሳሰር ዲዮነክስ ኣዮን ክሮማቶግራፊ ስርዓት (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ተጠቒምካ ተተንቲኑ። ብሓጺሩ 5μl ናይ መተቦላይት ቅብኣት ኣብ HPLC (2 mm×250 mm, particle size 4μm, Thermo Fisher Scientific) ዝተዓጠቐ Dionex IonPac AS11-HC ዓምዲ ብ push-in partial loop mode ብ1. )on ዝመላእ ሬሽዮ ተዋሂቡ። ዲዮነክስ ኣዮንፓክ AG11-HC ሓላዊ ዓምዲ (2 ሚ.ሜ x 50 ሚ.ሜ.፣ 4μm፣ ተርሞ ፊሸር ሳይንሳዊ)። ሙቐት ዓምዲ ኣብ 30 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ይዕቀብ፣ እቲ ኣውቶሳምፕለር ድማ ናብ 6 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ይቕመጥ። ብመንገዲ እቲ ኤሉየንት ጀነሬተር ኣቢልካ ፖታስየም ሃይድሮክሳይድ ግራድየንት ንምፍጣር ምስ ዲኣዮናይዝድ ማይ ዝተዳለወ ፖታስየም ሃይድሮክሳይድ ካርትሪጅ ተጠቐም። ምፍላይ መተቦላይት ብፍሰት 380μl/ደቒቕ፣ ነዚ ዝስዕብ ምዕባለ ብምትግባር: ካብ 0 ክሳብ 3 ደቓይቕ፣ 10 ሚሊ ሜትር KOH፤ ካብ 3 ክሳብ 12 ደቓይቕ፣ ካብ 10 ክሳብ 50 ሚሊ ሜትር KOH፤ ካብ 12 ክሳብ 19 ደቓይቕ፣ ካብ 50 ክሳብ 100 ሚሊ ሜትር KOH፤ ካብ 19 ክሳብ 21 ደቓይቕ , 100 ሚሊ ሜትር KOH; ካብ 21 ክሳብ 21.5 ደቓይቕ፡ ካብ 100 ክሳብ 10 ሚ.ሜ. እቲ ዓምዲ ኣብ ትሕቲ 10 ሚሊ ሜትር KOH ን8.5 ደቓይቕ ዳግማይ ሚዛን ተገይሩሉ።
እቶም ዝተሓጽቡ መተቦላይትስ ድሕሪ እቲ ዓምዲ ምስ 150μl/min ዝዓቐኑ ናይ ኣይሶፕሮፓኖል መመላእታ ዋሕዚ ይወሃሃዱ እሞ ድሕሪኡ ናብቲ ኣብ ኣሉታዊ ኣዮናይዜሽን ሞድ ዝሰርሕ ልዑል ርዝነት ዘለዎ ማስ ስፔክትሮሜተር ይቐንዑ። ኤምኤስ ካብ m/z 50 ክሳብ 750 ዝበጽሕ ደረጃ ጅምላ ብ60 ሽሕ ርዝነት ይከታተሎ ኣሎ። እቲ AGC ናብ 1×106 ተቐሚጡ፣ እቲ ዝለዓለ ናይ ኣዮን ግዜ ድማ ኣብ 100 ሚ.ሰ. እቲ ዝሃረመ ምንጪ ESI ብ3.5 ኪሎ ቮልት ቮልቴጅ ስፕራይ እዩ ዝሰርሕ ነይሩ። ካልኦት ቅጥዕታት ናይቲ ምንጪ ኣዮን ከምዚ ዝስዕብ እዮም፡ ሙቐት ሻምብቆታት ደም 275 ዲግሪ ሰንቲግሬድ፤ ዋሕዚ ጋዝ ሸፋሽፍቲ፣ 60 AU፤ ሓጋዚ ዋሕዚ ጋዝ፣ 20 AU ኣብ 300°C፣ ከምኡ’ውን S ሌንስ ናብ 60 AU ምቕማጥ።
ትንተና መረዳእታ ናይ 13C ምልክት ዘለዎም መተቦላይትስ. ንናይ ኣይሶቶፕ ሬሽዮ ትንተና ዳታ ትሬስፋይንደር ሶፍትዌር (ስሪት 4.2፣ ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) ተጠቐም። መንነት ነፍሲ ወከፍ ውሁድ ብዘተኣማምን መወከሲ ውህደት ተረጋጊጹ ብናጻ ተተንቲኑ። ትንተና ምህብታም ኣይሶቶፕ ንምፍጻም፡ ስፍሓት ናይቲ ዝተቐድሐ ኣዮን ክሮማቶግራም (XIC) ናይ ነፍሲ ወከፍ 13C ኣይሶቶፕ (Mn) ካብ [M + H] + ተቐዲሑ፡ n ቁጽሪ ካርቦን ናይቲ ዕላማ ውህደት ኮይኑ፡ ንኣሚኖ ኣሲዳት ንምትንታን ወይ [ MH] + ንኣንዮናት ንምትንታን ይጥቀመሉ። ልክዕነት ጅምላ XIC ትሕቲ ሓሙሽተ ክፋል ኣብ ሚልዮን ኮይኑ፡ ልክዕነት RT ድማ 0.05 ደቓይቕ እዩ። እቲ ናይ ምህብታም ትንተና ናይ ነፍሲ ወከፍ ዝተረኽበ ኣይሶቶፕ ምስ ድምር ናይ ኩሎም ኣይሶቶፕ ናይቲ ተዛማዲ ውህደት ብምሕሳብ እዩ ዝፍጸም። እዞም ሬሽዮታት ንነፍሲ ​​ወከፍ ኣይሶቶፕ ከም ሚእታዊት ክብርታት ይወሃቡ፣ ውጽኢት ድማ ከምቲ ኣቐዲሙ ዝተገልጸ ብሞላር ሚእታዊት ምህብታም (MPE) ይግለጽ (42)።
እቲ ፍሮዝን ኒውሮን ፔለት ኣብ በረድ ዝሑል 80% ሜታኖል (v/v) ሓደ ዓይነት ተገይሩ፣ ቮርቴክስ ተገይሩ፣ ኣብ -20 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን30 ደቓይቕ ተሓቢኡ። ነቲ ናሙና እንደገና ቮርቴክስ ብምግባር ኣብ +4°C ን30 ደቓይቕ ንቕልቅሎ። እቲ ናሙና ኣብ 21,000 ግ ን5 ደቓይቕ ኣብ 4 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ሴንትሪፉጅ ተገይሩ፣ ድሕሪኡ እቲ ዝረኸብናዮ ልዕሊ ማይ ተኣኪቡ ንቐፃሊ ትንተና ኣብ 25 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ብስፒድቫክ ኮንሰንትሬተር ተጠቒምካ ነቒፁ። ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተገልጸ ኣብ ኣሚኖ ኣሲዳት ናይቶም ዝተፈላልዩ ዋህዮታት LC-MS ትንተና ተኻይዱ። TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) ብምጥቃም ትንተና ዳታ ሞኖኣይሶቶፒክ ጅምላ ነፍሲ ወከፍ ውህደት ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። ኳንታይል ኖርማላይዜሽን ናይ ሜታቦላይት ዳታ ብ preprocessCore ሶፍትዌር ፓኬጅ ( 57 ) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ምድላው ስላይስ ። እቲ ኣንጭዋ ብቕልጡፍ ብካርቦን ዳይኦክሳይድ ተደኒሱ ርእሱ ተቖሪጹ፣ ሓንጎሉ ብቕልጡፍ ካብ ርእሲ ምራኽ ተኣልዩ፣ እቲ ብበረድ ዝተመልአ ምንቅጥቃጥ ካራ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ድማ ተጠቒሙ ናብ 300 ክሳብ 375 μm ሳጂታል ክፍልታት ቆሪጹ ዝሑል ካርቦን ጋሲፊኬሽን (95% O2ን 5% CO2ን) ትሑት Ca2 + ACSF (125.0 ሚሊ ሜትር NaCl፣ 2.5 ሚሊ ሜትር KCl፣ 1.25 ሚሊ ሜትር ሶድየም ፎስፌት መከላኸሊ፣ 25.0 ሚሊ ሜትር NaHCO3፣ 25.0 ሚሊ ሜትር ዲ-ግሉኮስ፣ 1.0 ሚሊ ሜትር CaCl2ን 6.0 ሚሊ ሜትር ሚግCl2ን ናብ ፒኤች 7.4ን 310 ክሳብ 330 ሚሊ ኦስ ሜትርን ምትዕርራይ)። እቶም ዝተረኸቡ ስላይስ ሓንጎል ናብ ዝለዓለ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ሶድየም ፎስፌት ባፈር፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2ን mM 3.5 MgCl2ን) pH 7.4ን ካብ 310 ክሳብ 320 mOsm)። እቶም ስላይስ ቅድሚ ምቕራጽካ ንኽምለሱ ካብ 20 ክሳብ 30 ደቓይቕ ኣቐምጦም።
ምቕዳሕ ምዃኑ’ዩ። ንኹሉ ቅዳሓት ብቐዋሚ መቕረጺ ክፍልን 20x ማይ ምጥሓል ዕላማ መነጽርን (Scientifica) ዝተዓጠቐ ማይክሮስኮፕ መድረኽ ተጠቒሙ። እቶም ዝግመቱ ዋህዮታት ፑርኪንጀ ብ(i) ዓቐን ኣካላት፡ (ii) ኣናቶሚካዊ ኣቀማምጣ ሴረቤለም፡ ከምኡ’ውን (iii) መግለጺ ናይቲ ፍሎረሰንት mtYFP ሪፖርተር ጂን ተለልዮም። እቲ ካብ 5 ክሳብ 11 ሜጎም ዝበጽሕ ተጻዋርነት ጫፍ ዘለዎ ፓች ፒፔት ብቦሮሲሊኬት ብርጭቆ ካፒላሪ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) ከምኡ’ውን ብኣግማድ ፒፔት Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) ይስሓብ። ኩሎም ቅዳሓት ብ ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany) ዝተኻየዱ ኮይኖም፡ እዚ ድማ ብሶፍትዌር Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) ዝቆጻጸር እዩ። እቲ ፈተነ ብ12.5 ኪሎ ሄርዝ ናሙና ምውሳድ እዩ ተመዝጊቡ። እቲ ምልክት ብኽልተ ሓጺር ምሕላፍ ዘለዎም ቤሰል ፍልትራት ዝጽረግ ኮይኑ ብቕደም ተኸተል 1.3ን 10 ኪሎ ሄርዝን ዝኾነ ናይ ምቁራጽ ፍሪኩዌንሲ ኣለዎም። ናይቲ ሽፋንን ፒፔትን ካፓሲታንስ ብኣምፕሊፋየር ተጠቒምካ ብናይ ካሕሳ ሰርኪዩት ይካሓስ። ኩሎም ፈተነታት ኣብ ትሕቲ ቁጽጽር ኦርካ-ፍላሽ 4.0 ካሜራ (ሃማማትሱ፡ ገርደን፡ ጀርመን) ዝተኻየዱ ኮይኖም፡ እዚ ካሜራ ብሆካዎ ሶፍትዌር (ስሪት 2.8፡ ሃማማትሱ፡ ገርደን፡ ጀርመን) ዝቆጻጸር እዩ።
ስሩዕ ኣወቓቕራን ትንተናን ምሉእ ዋህዮ። ቅድሚ ምምዝጋብካ ብቕጽበት ነቲ ፒፔት በቲ እዞም ዝስዕቡ ንጥረ ነገራት ዝሓዘ ውሽጣዊ ፍታሕ ምልኣዮ፡ 4.0 ሚሊ ሜተር KCl፡ 2.0 ሚሊ ሜተር NaCl፡ 0.2 ሚሊ ሜተር EGTA፡ 135.0 ሚሊ ሜተር ፖታስየም ግሉኮኔት፡ 10.0 ሚሊ ሜተር ሄፐስ፡ 4.0 ሚሊ ሜተር ኤቲፒ (Mg)፡ 0.5 ሚሊ ሜተር ጓኖሳይን ትራይፎስፌት (GTP) (Na)ን... 10.0 ሚሊ ሜትር ክሬቲኒን ፎስፌት ናብ ፒኤች 7.25 ተስተኻኺሉ፣ እቲ ኦስሞቲክ ፀቕጢ ድማ 290 ሚሊ ሜትር (ሱክሮስ) ነይሩ። ነቲ ሽፋን ንምብታኽ 0 pA ዝኾነ ሓይሊ ድሕሪ ምግባር ብኡንብኡ፡ ናይ ዕረፍቲ ሽፋን ዓቕሚ ተለኪዑ። እቲ ናይ ምእታው ተጻዋርነት -40፣ -30፣ -20፣ ከምኡውን -10 pA ዝኾኑ ሃይፐርፖላራይዝድ ዋሕዚታት ብምትግባር ይዕቀን። ንዓቐን ናይቲ ቮልቴጅ ምላሽ ምዕቃንን ናይ ምእታው ተጻዋርነት ንምሕሳብ ሕጊ ኦም ተጠቐም። ስፖንታይን ንጥፈታት ኣብ ቮልቴጅ ክላምፕ ን5 ደቓይቕ ተመዝጊቡ፣ sPSC ድማ ኣብ Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ብፍርቂ ኣውቶማቲክ ምልላይ ስክሪፕት ተጠቒምካ ተለልዩን ተለኪዑን። IV curveን steady-state currentን ንባትሪ ኣብ ዝተፈላለየ ፖተሽናል (ካብ -110 mV ጀሚሩ) ብምጭባጥን ብ5 mV ደረጃታት ቮልቴጅ ብምውሳኽን ይዕቀን። ምፍራይ ኤፒ ዲፖላራይዚንግ ካረንት ብምትግባር እዩ ተፈቲኑ። ዲፖላራይዚንግ ካረንት ፓልስ እናገበርካ ነቲ ዋህዮ ኣብ -70 ሚ.ቮ ምጭባጥ። ናይ ነፍሲ ወከፍ መቕረጺ ኣሃዱ ደረጃ ስጉምቲ ብተናጸል (ካብ 10 ክሳብ 60 pA) ኣስተኻኽል። ዝለዓለ ኤፒ ፍሪኩዌንሲ ዝፈጥሩ ናይ ናህሪ ስፓይክስ ብኢድካ ብምቑጻር ዝለዓለ ኤፒ ፍሪኩዌንሲ ኣስልጥ። እቲ ኤፒ ደረት ብመጀመርታ ሓደ ወይ ልዕሊኡ ኤፒ ዝድርኽ ካልኣይ መውጽኢ ናይቲ ዲፖላራይዘሽን ናህሪ ብምጥቃም እዩ ዝትንተን።
ነዃላት ዘለዎ ፓች ውቅርን ትንተናን ። ስታንዳርድ ፕሮቶኮላት ተጠቒምካ ነዃል ዘለዎ ፓች ምቕራጽ ምፍጻም። እዞም ዝስዕቡ ቀመማት ዘይሓዘ ካብ ATPን GTPን ነጻ ዝኾነ ፒፔት ተጠቐም፡ 128 mM ግሉኮኔት K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTAን 2 mM MgCl2ን፡ ናብ pH 7.2 ድማ ምትዕርራይ (KOH ብምጥቃም)። ኤቲፒን ጂቲፒን ካብቲ ውሽጣዊ ዋህዮ ፍታሕ ይግደፉ፣ እዚ ድማ ዘይተቖጻጸረ ምትሕልላፍ ናይቲ ሽፋን ዋህዮ ንምክልኻል እዩ። እቲ ፓች ፒፔት ብኣምፎተሪሲን ዝሓዘ ውሽጣዊ ፍታሕ (ኣስታት 200 ክሳብ 250 ማይክሮግራም/ሚሊ ሊትር፤ G4888፣ ሲግማ-ኣልድሪች) ብምምላእ መዝገብ ናይቲ ነዃል ዘለዎ ፓች ይረክብ። ኣምፎተሪሲን ኣብ ዳይሜቲል ሳልፎክሳይድ (ናይ መወዳእታ ትሕዝቶ: 0.1 ክሳብ 0.3%፤ DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) ፈሲሱ። እቲ ዝተጠቕመሉ ምትእኽኻብ ዲኤምኤስኦ ኣብቶም ዝተጽንዑ ኒውሮናት ዝኾነ ርኡይ ጽልዋ ኣይነበሮን። ኣብ መስርሕ ምጉስቋል፡ ተጻዋርነት ቻነል (Ra) ብቐጻሊ ይከታተል፡ እቲ ፈተነ ድማ ድሕሪ ምርግጋእ ምልክት Raን APን (20-40 ደቓይቕ) ተጀሚሩ። ድንገታዊ ንጥፈታት ኣብ ቮልቴጅን/ወይ ዋሕዚ ኤሌክትሪክን ን2 ክሳብ 5 ደቓይቕ ይዕቀን። ትንተና መረዳእታ ብኢጎር ፕሮ (ስሪት 7.05.2፣ ዌቭሜትሪክስ፣ ኣሜሪካ)፣ ኤክሰል (ስሪት 2010፣ ማይክሮሶፍት ኮርፖሬሽን፣ ሬድሞንድ፣ ኣሜሪካ)ን ግራፍፓድ ፕሪዝምን (ስሪት 8.1.2፣ ግራፍፓድ ሶፍትዌር ኢንክ፣ ላ ጆላ፣ ሲኤ) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። ሕቡራት መንግስታት ኣመሪካ)። ስፖንታይን ኤፒ ንምልላይ፡ ናይ IgorPro NeuroMatic v3.0c ፕላግ-ኢን ይጥቀም። ዝተዋህበ ደረት ተጠቒምካ ኤፒታት ብኣውቶማቲክ ምልላይ፣ እዚ ድማ ንነፍሲ ​​ወከፍ መዝገብ ብውልቂ ይስተኻኸል። ነቲ ናይ ስፓይክ ኢንተርቫል ብምጥቃም፡ ነቲ ስፓይክ ፍሪኩዌንሲ ምስቲ ዝለዓለ ቅጽበታዊ ስፓይክ ፍሪኩዌንሲን ማእከላይ ስፓይክ ፍሪኩዌንሲን ውሰድ።
ፒኤን ተነጽሎ። ምስቲ ኣቐዲሙ ዝተሓትመ ፕሮቶኮል ብምትዕጽጻፍ፡ ፒኤን ካብ ሴረቤሉም ኣንጭዋ ኣብ ዝተወሰነ ደረጃ ተጸሪጉ (58)። ብሓጺሩ፡ እቲ ሴረቤሉም ተቖሪጹን ኣብ በረድ ዝሑል ምፍንጫል መሳርሒ [ብዘይ HBSS Ca2+ን Mg2+ን፡ ብ20 ሚሊ ሜተር ግሉኮስ፡ ፔኒሲሊን (50 U/ml)ን ስትረፕቶማይሲንን (0.05 ሚግ/ ሚሊ ሊትር)ን ተደሚሩ] ተቖሪጹ፡ ድሕሪኡ ነቲ ማእከላይ ኣብ ፓፓይን [HBSS፡ ብ1-cysteine·HCl ዝተመላእ እዩ። (1 ሚግ / ሚሊ ሊትር)፣ ፓፓይን (16 U / ሚሊ ሊትር)ን ዲኦክሲራይቦኑክሊየዝ I (DNase I; 0.1 mg/ml)] ን30 ደቓይቕ ኣብ 30 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ምሕካም። መጀመርታ ነቶም ቲሹታት ኣብ ናይ እንቋቑሖ ምውቃጥ (10 ሚግ/ሚሊ ሊትር)፡ BSA (10 ሚግ/ሚሊ ሊትር)ን DNase (0.1 ሚግ/ሚሊ ሊትር)ን ዝሓዘ HBSS ማእከላይ ኣብ ናይ ክፍሊ ሙቐት ምሕጻብ፡ ብኢንዛይማዊ ምሕቃቕ መግቢ ንምክልኻል፡ ድሕሪኡ ድማ ኣብቲ 20 mM ግሉኮስ ዝሓዘ HBSS medium ቀስ ኢልካ ኣብ HBSS፡ ፔኒሲሊን (50 U/ml)፡ ስትረፕቶማይሲን (0.05 mg/ml)ን ምፍሓር DNase (0.1 mg/ml) ንጽል ዋህዮታት ይለቅቕ። እቲ ዝረኸብናዮ ዋህዮ ምትዕንቓፍ ብ70μm ዋህዮ መጽረዪ ተጻሪዩ፣ ድሕሪኡ እቶም ዋህዮታት ብሴንትሪፉጌሽን (1110 rpm, 5 ደቓይቕ፣ 4°C) ተለኺዮም ኣብ ምፍላይ ማእከላይ [HBSS, supplemented with 20 mM glucose, 20% fetal bovine ) Serum, penicillin (50 U/ml) and streptomycin ዳግማይ ተዓጽዮም (0.05 ሚሊግራም/ሚሊ ሊትር)]፤ ንህላወ ዋህዮታት ብፕሮፒድየም ኣዮዳይድ ምግምጋምን ጽቕጥቕጥ ዋህዮታት ናብ 1×106 ክሳብ 2×106 ዋህዮታት/ሚ.ሊ. ቅድሚ ፍሎው ሳይቶሜትሪ እቲ ስንብራት ብ50 ማይክሮሜትር ዋህዮ መጽረዪ ተጻሪዩ።
ፍሎው ሳይቶሜተር። ምፍላይ ዋህዮታት ኣብ 4°C FACSAria III ማሽን (BD Biosciences)ን FACSDiva ሶፍትዌርን (BD Biosciences, version 8.0.1) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ። እቲ ዋህዮ ስንብራት 100 ማይክሮሜትር ኖዝል ኣብ ትሕቲ 20 psi ጸቕጢ ብ ~2800 ፍጻመታት/ሰከንድ ፍጥነት ተፈላልዩ። ባህላዊ መዐቀኒታት ምዕጻው (ዓቐን ዋህዮታት፡ ባይሞዳል ኣድልዎ፡ ከምኡ’ውን ባህርያት ፋሕፋሕ) ቅኑዕ ተነጽሎ ፒኤን ካብ ካልኦት ዓይነታት ዋህዮታት ከረጋግጽ ስለዘይክእል፡ እቲ ስትራተጂ ምኽፋት ኣብ ቀጥታዊ ምውድዳር ጽዓትን ኣውቶፍሎረሰንስን YFP ኣብ mitoYFP+ን ቁጽጽር mitoYFP − ኣእዋምን ዝተመርኮሰ እዩ። YFP ነቲ ናሙና ብ488 ና.ሜ መስመር ሌዘር ብምብራህ ይሕጎስ፣ እቲ ምልክት ድማ 530/30 ና.ሜ ባንድ ፓስ ፍልተር ተጠቒምካ ይፍለጥ። ኣብ mitoYFP+ ​​ዝበሃሉ ኣእዋም፡ ተዛማዲ ሓይሊ ናይቲ Rosa26-mitoYFP ሪፖርተር ጂን፡ ንቑርጽራጽ ኣካላት ኒውሮንን ኣክሶንን ንምፍላይ እውን ይጥቀመሉ። 7-AAD ብ561 ና.ሜ ብጫ ሌዘር ተደሪኹ ብ675/20 ና.ሜ ባንድፓስ ፍልተር ይፍለጥ ንዝሞቱ ዋህዮታት ንምግላል። ኣብ ሓደ እዋን ኣስትሮሳይት ንምፍላይ፡ እቲ ዋህዮ ስንብራት ብACSA-2-APC ተለኺዩ፡ ድሕሪኡ እቲ ናሙና ብ640 ና.ሜ መስመር ሌዘር ጨረርታ ተገይሩሉ፡ ነቲ ምልክት ንምፍላጥ ድማ 660/20 ና.ሜ ባንድፓስ ፍልተር ተጠቒሙ።
እቶም ዝተኣከቡ ዋህዮታት ብሴንትሪፉጌሽን (1110 rpm, 5 ደቓይቕ, 4°C) ተለኺዮም ክሳብ ዝጥቀሙ ኣብ -80°C ተዓቂቦም። Mfn2cKO ዝበሃሉ ኣእዋምን ናይ ጐሓፍ ሻምብቆታቶምን ኣብ ሓደ መዓልቲ ይምደቡ፣ እዚ ድማ ንኣገባባዊ ተለዋዋጢነት ንምንካይ እዩ። FACS ዳታ ምቕራብን ትንተናን FlowJo ሶፍትዌር (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ተጠቒምካ እዩ ተኻይዱ።
ከምቲ ኣብ ላዕሊ ዝተጠቕሰ (59)፡ ኣብ ሓቀኛ ግዜ ፒሲኣር ካብቶም ዝተሰርዑ ኒውሮናት ዲኤንኤ ንምንጻል ንቐጻሊ ቁጽሪ mtDNA ይጥቀም። እቲ መስመራዊነትን ደረት ተነቃፍነትን ኣብ መጀመርታ ኣብ ዝተፈላለዩ ቁፅሪ ዋህዮታት qPCR ብምክያድ እዩ ተፈቲኑ። ብሓፂሩ 300 PN ኣብ 50 mM tris-HCl (pH 8.5)፣ 1 mM EDTA፣ 0.5% Tween 20ን proteinase Kን (200 ng/ml) ዝሓዘ lysis buffer ኣኪብና ኣብ 55°C ን120 ደቓይቕ ምሕቃቕ። እቶም ዋህዮታት ብተወሳኺ ኣብ 95 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን10 ደቓይቕ ተሓቢኦም ምሉእ ብምሉእ ዘይምንቅስቓስ ፕሮቲነዝ ኬ ንምርግጋጽ ተገይሩ።ንmt-Nd1 ፍሉይ ዝኾነ TaqMan probe (Thermo Fisher) ብምጥቃም mtDNA ብsemi-quantitative PCR ኣብ 7900HT Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific) ተለኪዑ። ሳይንስ፣ ቁጽሪ ካታሎግ Mm04225274_s1)፣ mt-Nd6 (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ቁጽሪ ካታሎግ AIVI3E8) ከምኡ’ውን 18S (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ቁጽሪ ካታሎግ Hs99999901_s1) ጂናት።
ምድላው ናሙና ፕሮቲዮም። ነቲ ፍታሕ ኣብ 95 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ን10 ደቓይቕ ብምውዓይን ሶኒኬት ብምግባርን፣ ኣብቲ lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide and 100 mM tris- Lyse frozen neuron pellets in HCl]። ኣብ ባዮሩፕተር (Diagenode) ን10 ደቓይቕ (30 ካልኢት ናህሪ / 30 ካልኢት ናይ ዕረፍቲ ግዜ)። እቲ ናሙና ኣብ 20 ሚሊ ሜትር ትራይስ-ኤችሲኤል (ፒኤች 8.0) 1:10 ተቐላቒሉ፡ ምስ 300 ng ትሪፕሲን ወርቂ (ፕሮሜጋ) ተሓዋዊሱ፡ ምሉእ ምሕቃቕ ንምብጻሕ ኣብ 37 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ንሓደ ለይቲ ተሓቢኡ። ኣብ ካልኣይ መዓልቲ ድማ እቲ ናሙና ኣብ 20 ሽሕ ግ ን20 ደቓይቕ ሴንትሪፉጅ ተገይሩሉ። እቲ ኣብ ልዕሊኡ ዝነበረ ማይ ብ0.1% ፎርሚክ ኣሲድ ተቐላቒሉ፣ እቲ ፍታሕ ድማ ብባዕሉ ብዝሰርሖ ስቴጅቲፕስ ጨው ተኣልዩ። እቲ ናሙና ኣብ መሳርሒ SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) ኣብ 45°C ነቒጹ፣ ድሕሪኡ እቲ ፔፕታይድ ኣብ 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ ተሰቒሉ። ኩሎም ናሙናታት ብሓንሳብ ብሓደ ሰብ ዝተዳለዉ እዮም። ናሙናታት ኣስትሮሳይት ንምትንታን 4 ማይክሮግራም ጨው ዘይብሎም ፔፕታይድስ ብታንደም ማስ ታግ (TMT10plex, ካታሎግ ቁጽሪ 90110፣ ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) ብፔፕታይድ ምስ TMT ሪኣጀንት ሬሽዮ 1:20 ምልክት ተገይሩሎም። ንTMT ምልክት ምግባር 0.8 ሚሊግራም TMT reagent ኣብ 70 μl ማይ ዘይብሉ ACN ዳግማይ ተዓጽዩ፣ እቲ ዝነቐጸ ፔፕታይድ ድማ ናብ 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) ዳግማይ ተዋዲዱ፣ ኣብኡ ድማ 7 μl TMT reagent ኣብ ACN ተወሰኸሉ። እቲ ምትእኽኻብ 43.75% ነይሩ። ድሕሪ 60 ደቓይቕ ምሕቃቕ እቲ ምላሽ ብ2 μl 5% ሃይድሮክሲላሚን ተዓጽዩ። እቶም ምልክት ዝተገብረሎም ፔፕታይድስ ተኣኪቦም፡ ነቒጾም፡ ኣብ 200μl 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ (FA) ዳግማይ ተዓጽዮም፡ ኣብ ክልተ ተኸፋፊሎም፡ ድሕሪኡ ባዕሎም ዝሰርሕዎ StageTips ተጠቒሞም ጨው ተኣልዮም። UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) ብምጥቃም፡ ሓደ ካብቶም ክልተ ፍርቂ ኣብ 1mm x 150mm Acquity chromatographic column ብ130Å1.7μm C18 ንጥረ ነገራት ዝተመልአ (Waters, catalog No. SKU: 186006935) ተኸፋፊሉ። ተርሞ ፊሸር ሳይንሳዊ)። ፔፕታይድስ ብፍሰት 30μl/ደቒቕ ምፍላይ፣ ካብ 1% ክሳብ 50% መከላኸሊ B ን85 ደቓይቕ ብደረጃ ብደረጃ 96 ደቓይቕ፣ ካብ 50% ክሳብ 95% መከላኸሊ B ን3 ደቓይቕ፣ ድሕሪኡ ን8 ደቓይቕ ን95 % መከላኸሊ B ምፍላይ፤ መከላኸሊ A 5% ACNን 10 mM ኣሞንየም ባይካርቦኔትን (ABC) ክኸውን ከሎ፡ መከላኸሊ B ድማ 80% ACNን 10 mM ABCን እዩ። ኣብ ነፍሲ ወከፍ 3 ደቓይቕ ክፋላት ኣኪብካ ኣብ ክልተ ጉጅለ (1 + 17, 2 + 18 ወዘተ) ኣወሃሂድካ ኣብ ቫክዩም ሴንትሪፉጅ ኣንቅጾ።
LC-MS/MS ትንተና። ንማስ ስፔክትሮሜትሪ፡ እቶም ፔፕታይድስ (ቁጽሪ r119.aq) ኣብ 25 ሴንቲ ሜተር፡ 75 ማይክሮሜትር ውሽጣዊ ዲያሜትር ዘለዎ ፒኮፍሪት ትንተናዊ ዓምዲ (ሓድሽ ዕላማ ሌንስ፡ ቁጽሪ ክፍሊ PF7508250) ብ1.9 ማይክሮሜትር ReproSil-Pur 120 C18-AQ ማእከላይ (Dr. Maisch, mat) ዝተዓጠቐ፡ EASY-nLC ተጠቒሞም ተፈላልዮም 1200 (ተርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፡ ጀርመን)። እቲ ዓምዲ ኣብ 50 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ተዓቂቡ። መከላኸሊታት Aን Bን ኣብ ማይ 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ ኣብ 80% ACN ድማ 0.1% ፎርሚክ ኣሲድ እዮም። ፔፕታይድስ ብደረጃ ደረጃ 200 nl/min ካብ 6% ክሳብ 31% መከላኸሊ B ን65 ደቓይቕ፣ ካብ 31% ክሳብ 50% መከላኸሊ B ን5 ደቓይቕ ድማ ተፈላልዮም። እቶም ዝተሓጽቡ ፔፕታይድስ ብኦርቢትራፕ ፍዩዥን ማስ ስፔክትሮሜተር (Thermo Fisher Scientific) ተተንቲኖም እዮም። ምልካዕ ፔፕታይድ ፕሪከርሰር m/z ካብ 350 ክሳብ 1500 m/z ዝበጽሕ ርዝነት 120,000 ሒዙ ይፍጸም። 27% ንቡር ዝኾነ ናይ ምግጫው ጸዓት ብምጥቃም፡ እቲ ዝሓየለ ቅድመ-ኩነት ምስ ቻርጅ ኩነታት ካብ 2 ክሳብ 6 ንልዑል ጸዓት C መጻወድያ ምፍንጫል (HCD) ምብትታን ይምረጽ። እቲ ናይ ዑደት ግዜ ናብ 1 s ተቐሚጡ ኣሎ። እቲ m/z ዋጋ ናይቲ ፔፕታይድ ቁንጣሮ ኣብ መጻወድያ ኣዮን ዝነኣሰ AGC ዕላማ 5×104ን ዝለዓለ ናይ መርፍእ ግዜ 86 msን ተጠቒምካ እዩ ተለኪዑ። ድሕሪ ምብትታን እቲ ቅድመ-ኩነት ኣብ ዝርዝር ዳይናሚክ ምግላል ን45 s ተቐሚጡ። TMT-labeled ፔፕታይድስ ኣብ 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap ዓምዲ (Thermo Fisher Scientific, catalog number 164942) ተፈላልዮም፣ እቶም ናይ ስደት ስፔክትራታት ድማ ኣብ Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ብዝተዓጠቐ ልዑል-ሜዳ ዘይምዕሩይ ቅርጺ ማዕበል ኣዮናት (FAIMS) መሳርሒታት ተተንቲኖም (Thermo Fisher Scientific) ኣብ ክልተ ናይ ካሕሳ ቮልቴጅ −50ን −70 Vን ይሰርሕ።MS3 ብመሰረት synchronization precursor ዝተመርጸ ንመዐቀኒ TMT ጸብጻብ ኣዮን ምልክት ይጥቀመሉ። እቲ ምፍላይ ፔፕታይድ ኣብ EASY-nLC 1200 ተኻይዱ፣ 90% መስመራዊ ግራድየንት ኤሉሽን ተጠቒምካ፣ ካብ 6% ክሳብ 31% ምትእኽኻብ መከላኸሊ፤ መከላኸሊ A 0.1% FA፣ መከላኸሊ B ድማ 0.1% FAን 80% ACNን ነይሩ። እቲ ናይ ትንተና ዓምዲ ኣብ 50 ዲግሪ ሰንቲግሬድ ይሰርሕ። ነቲ ኦሪጅናል ፋይል ብመሰረት ናይ FAIMS ካሕሳ ቮልቴጅ ንምምቃል FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) ተጠቐም።
ፕሮቲን ምልላይን ብዝሒ ምውሳንን። ዝተዋሃሃደ ሞተር ምድላይ ኣንድሮሜዳ ብምጥቃም፡ እቲ መበቆላዊ ዳታ ብማክስክዋንት ስሪት 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ተጠቒምካ እዩ ተተንቲኑ። ብዘይካ እቲ ካብ Aequorea victoria ዝተረኽበ Cre recombinaseን YFPን መስርዕ፡ ፔፕታይድ ቁርጽራጽ ስፔክትራ ቀኖናዊ መስርዕን isoform መስርዕን ናይቲ ናይ ኣንጭዋ መወከሲ ፕሮቲዮም (Proteome ID UP000000589, downloaded from UniProt in May 2017) ተፈቲሹ። ሜቲዮኒን ኦክሳይድን ፕሮቲን N-terminal acetylationን ከም ተለዋዋጢ ምምሕያሻት ተቐሚጦም፤ ሲስተይን ካርባሞይል ሜቲለሽን ከም ጽኑዕ ምምሕያሻት ተቐሚጡ። እቶም ናይ ምሕቃቕ መግቢ መለክዒታት ናብ “ፍሉይነት”ን “ትሪፕሲን/ፒ”ን ይቕመጡ። ንፕሮቲን ምልላይ ዝውዕሉ ዝተሓተ ቁፅሪ ፔፕታይድስን ራዘር ፔፕታይድስን 1 እዩ፤ እቲ ዝተሓተ ቁጽሪ ፍሉያት ፔፕታይድስ 0. ኣብ ትሕቲ ኩነታት ምትእስሳር ካርታ ፔፕታይድ፡ ደረጃ ምልላይ ፕሮቲን 0.01 ነይሩ። እቲ “ካልኣይ ፔፕታይድ” ዝብል ኣማራጺ ተኸፊቱ ኣሎ። ኣብ መንጎ ዝተፈላለዩ ኦርጅናል ፋይላት ዕዉት መለለዪታት ንምስግጋር “match between runs” ዝብል ኣማራጺ ተጠቐም። ካብ ምልክት ነጻ ዝኾነ ቁጽሪ ምውሳን (LFQ) LFQ ዝተሓተ ሬሽዮ ቁጽሪ 1 ተጠቐም (60)። እቲ LFQ ጽዓት ብውሑዱ ንኽልተ ቅኑዓት ክብርታት ብውሑዱ ኣብ ሓደ ጂኖታይፕ ጉጅለ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ናይ ግዜ ነጥቢ ይጽረግ፣ ካብ ንቡር ዝርገሐ ድማ ምስ ስፍሓት ናይ... 0.3 ንታሕቲ ድማ 1.8 ይንቀሳቐስ። ንውጽኢት LFQ ንምትንታን ፐርሰስ ኮምፒዩቲንግ ፕላትፎርም (https://maxquant.net/perseus/) ከምኡ’ውን R (https://r-project.org/) ተጠቐም። ካብ limma ሶፍትዌር ፓኬጅ ክልተ-ኣንፈት ማእከላይ t ፈተና ንዲፈረንሻል መግለጺ ትንተና ተጠቒሙ ( 61 ). ዳህሳስ ዳታ ትንተና ggplot, FactoMineR, factoextra, GGallyን pheatmapን ተጠቒምካ እዩ ዝፍፀም። እቲ ኣብ TMT ዝተመርኮሰ መረዳእታ ፕሮቲዮሚክስ ብ MaxQuant version 1.6.10.43 ተጠቒምካ እዩ ተተንቲኑ። ካብቲ ኣብ መስከረም 2018 ዝወረደ ናይ ዩኒፕሮት ናይ ሰብ ፕሮቲዮሚክስ ዳታቤዝ ጥረ ፕሮቲዮሚክስ ዳታ ድለዩ።እቲ ትንተና በቲ ኣፍራዪ ዝቐረበ ናይ ኣይሶቶፕ ጽሬት መእረምታ ረቛሒ ዘጠቓልል እዩ። ንዲፈረንሻል መግለጺ ትንተና ኣብ R limma ተጠቐም። እቲ ኦሪጅናል ዳታ፣ ውጽኢት ምድላይ ዳታቤዝ፣ ከምኡ’ውን ዋሕዚ ስራሕን ውጽኢት ትንተና ዳታን ኩሎም ብመንገዲ PRIDE partner repository ምስ data set identifier PXD019690 ኣብ ProteomeXchange alliance ይኽዘኑ።
ተግባራዊ መግለጺታት ነቲ ትንተና የሀብትሞ። ሃብታም ተግባራዊ መግለጺ ቃላት ናይቲ ኣብ 8 ሰሙን ዝተቐመጠ ዳታ ንምፍላጥ መሳርሒ ትንታነ መንገዲ ብልሓት (QIAGEN) ተጠቒሙ (ስእሊ 1)። ብሓጺሩ ካብ LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ዳታ ትንተና ዝተረኽበ ብዝሒ ፕሮቲን ዝርዝር ምስዞም ዝስዕቡ ናይ ፍልተር መዐቀኒታት ይጥቀም፡ Mus musculus ከም ዓሌትን ድሕረ ባይታን ይምረጽ፡ እቲ ምድብ ድማ ብቤንጃሚኒ ዝተስተኻኸለ P ዋጋ ንሃብታም 0.05 ወይ ትሕቲኡ ከም ትርጉም ዘለዎ ይቑጸር። ነዚ ግራፍ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ክላስተር ብመሰረት ዝተስተኻኸለ P ዋጋ ዝተመስረቱ ላዕለዎት ሓሙሽተ ትርፊ ምድባት ተገሊፆም ኣለው። ብዙሕ t-test ብምጥቃም፣ ክልተ ደረጃታት ዘለዎ መስመራዊ ምዕባይ ፕሮግራም ናይ ቤንጃሚኒ፣ ክሪገርን የኩቲየሊን (Q = 5%) ብምጥቃም፣ ኣብ ነፍሲ ወከፍ ምድብ ዝተለለዩ ኣገደስቲ ሕጹያት ናይ ግዜ-ኮርስ ፕሮቲን መግለጺ ትንተና ይፍጸም፣ ነፍሲ ወከፍ መስርዕ ድማ ብተናጸል ይትንተን። ቅኑዕ SD ምቕባል ኣየድልን።
ውጽኢት ናይዚ መጽናዕቲ ምስ ዝተሓትሙ ዳታቤዛት ንምንጽጻርን ኣብ ስእሊ 1 ቬን ዳያግራም ንምፍጣርን፡ ነቲ ብዝሒ ፕሮቲን ዝርዝር ምስ ሚቶካርታ 2.0 መግለጺታት ኣወሃሂድናዮ (24)። ነቲ ስእላዊ ስእሊ ንምፍጣር ነቲ ናይ ኦንላይን መሳርሒ Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ተጠቐም።
ንፕሮቲዮሚክስ ትንተና ዝጥቀሙሉ ስታቲስቲካዊ ኣገባባት ዝርዝር ሓበሬታ ንምርካብ፡ በጃኹም ኣብቲ ተዛማዲ ክፍሊ ንዋትን ኣገባባትን ተወከሱ። ንኹሎም ካልኦት ፈተነታት፡ ዝርዝር ሓበሬታ ኣብቲ ተዛማዲ ኣፈ-ታሪኽ ክትረኽቦ ትኽእል ኢኻ። ብኻልእ መንገዲ እንተዘይተገለፀ ኩሉ መረዳእታ ብማእኸላይ ± SEM ዝግለፅ ኮይኑ ኩሎም ስታቲስቲካዊ ትንተናታት ድማ GraphPad Prism 8.1.2 ሶፍትዌር ተጠቒሞም እዮም ተኻይዶም።
ነዚ ጽሑፍ ዝኸውን ተወሳኺ ጽሑፋት ንምርካብ፡ በጃኹም http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ተወከሱ
እዚ ብመሰረት ውዕል ክሪኤቲቭ ኮመንስ ኣትሪብዩሽን-ዘይንግዳዊ ፍቓድ ዝተዘርግሐ ክፉት ተበጻሕነት ዘለዎ ጽሑፍ ኮይኑ፡ ኣብ ዝኾነ ማዕከን ዜና ምጥቃም፡ ምዝርጋሕን ምብዛሕን ዘፍቅድ ኮይኑ፡ እቲ ናይ መወዳእታ ኣጠቓቕማ ንንግዳዊ መኽሰብ ክሳብ ዘይኮነን እቲ መበገሲ ስራሕ ቅኑዕ ምዃኑን ክሳብ ዝኾነን እዩ። መጣቀሲ።
መተሓሳሰቢ፡ እቲ ናብቲ ገጽ ዝመኽርካዮ ሰብ ነቲ ኢመይል ክርእዮ ከም እትደልዮን ስፓም ከም ዘይኮነን ምእንቲ ክፈልጥ ጥራይ ኢና ኢመይልካ ክትህብ ንሓትት። ዝኾነ ናይ ኢመይል ኣድራሻ ኣይንሕዝን ኢና።
እዚ ሕቶ እዚ በጻሒ ምዃንካ ንምፍታንን ኣውቶማቲክ ስፓም ምቕራብ ንምክልኻልን ዝውዕል እዩ።
ብኢ ሞቶሪ፡ ኣይ ኣታናሶቭ፡ ኤስ ኤም ቪ ኮቻን፡ ኬ ፎልዝ-ዶናሁ፡ ቪ ሳክቲቨሉ፡ ፒ ጂያቫሊስኮ፡ ኤን ቶኒ፡ ጀይ ፑያል፡ ኤን-ጂ. ላርሰን ዝበሃሉ ምሁራት ምዃኖም ይፍለጥ
ፕሮቲዮሚክስ ትንተና ናይ ዘይሰርሑ ኒውሮናት ከም ዘመልክቶ፡ መደባት ምትሕውዋስ መግቢ ንኒውሮዲጀነሬሽን ንምምካት ከም ዝንቀሳቐሱ ኣረጋጊጹ።
ብኢ ሞቶሪ፡ ኣይ ኣታናሶቭ፡ ኤስ ኤም ቪ ኮቻን፡ ኬ ፎልዝ-ዶናሁ፡ ቪ ሳክቲቨሉ፡ ፒ ጂያቫሊስኮ፡ ኤን ቶኒ፡ ጀይ ፑያል፡ ኤን-ጂ. ላርሰን ዝበሃሉ ምሁራት ምዃኖም ይፍለጥ
ፕሮቲዮሚክስ ትንተና ናይ ዘይሰርሑ ኒውሮናት ከም ዘመልክቶ፡ መደባት ምትሕውዋስ መግቢ ንኒውሮዲጀነሬሽን ንምምካት ከም ዝንቀሳቐሱ ኣረጋጊጹ።
©2020 ማሕበር ምዕባለ ሳይንስ ኣሜሪካ። ኩሉ መሰላት ዝተሓለወ እዩ። AAAS መሻርኽቲ ናይ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ከምኡ ውን COUNTER እዩ። ሳይንስኣድቫንስ ISSN 2375-2548።